Ecotoxicological Impact of the Bioherbicide Leptospermone on the Microbial Community of Two Arable Soils

EA BIOmEInternational audienceThe ecotoxicological impact of leptospermone, a β-triketone bioherbicide, on the bacterial community of two arable soils was investigated. Soil microcosms were exposed to 0× (control), 1× or 10× recommended dose of leptospermone. The β-triketone was moderately adsorbed to both soils (i.e.,: K fa ∼ 1.2 and K −1 oc ∼ 140 mL g). Its dissipation was lower in sterilized than in unsterilized soils suggesting that it was mainly influenced by biotic factors. Within 45 days, leptospermone disappeared almost entirely from one of the two soils (i.e., DT 50 < 10 days), while 25% remained in the other. The composition of the microbial community assessed by qPCR targeting 11 microbial groups was found to be significantly modified in soil microcosms exposed to leptospermone. Pyrosequencing of 16S rRNA gene amplicons showed a shift in the bacterial community structure and a significant impact of leptospermone on the diversity of the soil bacterial community. Changes in the composition, and in the α-and β-diversity of microbial community were transient in the soil able to fully dissipate the leptospermone, but were persistent in the soil where β-triketone remained. To conclude the bacterial community of the two soils was sensitive to leptospermone and its resilience was observed only when leptospermone was fully dissipated

Isolation and characterization of Bradyrhizobium sp. SR1 degrading two β-triketone herbicides

In this study, a bacterial strain able to use sulcotrione,a β-triketone herbicide, as sole source of carbon and energy was isolated from soil samples previously treated with this herbicide. Phylogenetic study based on16S rRNA gene sequence showed that the isolate has 100 % of similarity with several Bradyrhizobium and was accordingly designated as Bradyrhizobium sp. SR1. Plasmid profiling revealed the presence of a large plasmid (>50 kb) in SR1 not cured under nonselective conditions. Its transfer to Escherichia coli by electroporation failed to induce β-triketone degrading capacity,suggesting that degrading genes possibly located on this plasmid cannot be expressed in E. coli or that they are not plasmid borne. The evaluation of the SR1 ability to degrade various synthetic (mesotrione and tembotrione) and natural (leptospermone) triketones showed that this strain was also able to degrademesotrione. Although SR1 was able to entirely dissipate both herbicides, degradation rate of sulcotrione was ten times higher than that of mesotrione, showing a greater affinity of degrading-enzyme system to sulcotrione. Degradation pathway of sulcotrione involved the formation of 2-chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA), previously identified in sulcotrione degradation, and of a new metabolite identified as hydroxy-sulcotrione.Mesotrione degradation pathway leads to the accumulation of-methylsulfonyl-2-nitrobenzoic acid(MNBA) and 2-amino-4 methylsulfonylbenzoic acid(AMBA), two well-known metabolites of this herbicide. Along with the dissipation of β-triketones, one could observe the decrease in 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(HPPD) inhibition, indicating that toxicity was due to parent molecules, and not to the formed metabolites. This is the first report of the isolation of bacterial strain able to transform two β-triketones

Lab to Field Assessment of the Ecotoxicological Impact of Chlorpyrifos, Isoproturon, or Tebuconazole on the Diversity and Composition of the Soil Bacterial Community

Pesticides are intentionally applied to agricultural fields for crop protection. They can harm non-target organisms such as soil microorganisms involved in important ecosystem functions with impacts at the global scale. Within the frame of the pesticide registration process, the ecotoxicological impact of pesticides on soil microorganisms is still based on carbon and nitrogen mineralization tests, despite the availability of more extensive approaches analyzing the abundance, activity or diversity of soil microorganisms. In this study, we used a high-density DNA microarray (PhyloChip) and 16S rDNA amplicon next-generation sequencing (NGS) to analyze the impact of the organophosphate insecticide chlorpyrifos (CHL), the phenyl-urea herbicide isoproturon (IPU), or the triazole fungicide tebuconazole (TCZ) on the diversity and composition of the soil bacterial community. To our knowledge, it is the first time that the combination of these approaches are applied to assess the impact of these three pesticides in a lab-to-field experimental design. The PhyloChip analysis revealed that although no significant changes in the composition of the bacterial community were observed in soil microcosms exposed to the pesticides, significant differences in detected operational taxonomic units (OTUs) were observed in the field experiment between pesticide treatments and control for all three tested pesticides after 70 days of exposure. NGS revealed that the bacterial diversity and composition varied over time. This trend was more marked in the microcosm than in the field study. Only slight but significant transient effects of CHL or TCZ were observed in the microcosm and the field study, respectively. IPU was not found to significantly modify the soil bacterial diversity or composition. Our results are in accordance with conclusions of the Environmental Food Safety Authority (EFSA), which concluded that these three pesticides may have a low risk toward soil microorganisms

Genomics based approach to identify the genes involved in ipu mineralization in sphingomonas sp.sh

Phenylurea herbicide isoproturon, 3-(4-isopropylphenyl)-1,1-dimethylurea (IPU), was found to be rapidly mineralised in aFrench agricultural soil previously exposed to IPU. A bacterial strain able to metabolise IPU was isolated from this soil adapted toIPU mineralization

Etude de l'évolution du potentiel génétique de populations bactériennes dégradant l'atrazine

L atrazine, un des herbicides les plus utilisés pour contrôler le développement des plantes adventices dans les cultures, a conduit à la contamination de l environnement. L exposition chronique à cet herbicide a conduit à l émergence de populations microbiennes du sol capables de dégrader l atrazine et de l utiliser comme une source d azote pour leur croissance. Ces populations microbiennes sont responsables de la biodégradation accélérée (BDA) de l atrazine, un service écosystémique contribuant à diminuer la persistance de cet herbicidedans l environnement. L objectif de ce travail était d étudier les mécanismes génétiques et physiologiques responsables du fonctionnement et de l amélioration de ce service écosystémique. Nous avons appliqué une démarche expérimentale allant des gènes codant la dégradation à des communautés microbiennes afin d identifier les processus adaptatifs impliqués dans l évolution de la fonction de BDA de l atrazine.Le premier volet a consisté à évaluer l importance de mutations accumulées dans le gène atzA dans la transformation de l atrazine en hydroxyatrazine catalysée par AtzA. Le séquençage de gènes atzA de différents isolats bactériens dégradant l atrazine (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps et différents Chelatobacter heintzii) a montré que la séquence du gène atzA était très conservée. Toutefois quatre mutations non silencieuses ont pu être identifiées (1 chez Pseudomonas sp. ADP MSE et 3 chez Chelatobacterheintzii). La modélisation de la structure de la protéine AtzA a permis de montrer que trois des mutations étaient situées dans des régions importantes (site actif, poche de liaison avec l atrazine et liaison avec le métalFe2+. [...] Le second volet a consisté à étudier la plasticité de la voie de biodégradation de l atrazine dans deux conditions opposées : (i) la première visait à évaluer la persistance de la capacité de dégradation en absence de pression de sélection et (ii) la seconde visait à évaluer l évolution de la capacité de dégradation en présence d une pression de sélection élevée. Pour conduire ces études, des manipulations d évolution expérimentale sur Pseudomonas sp. ADP ont été menées. (i) L exposition à l acide cyanurique, intermédiaire métabolique de l atrazine, a conduit à la sélection d une population nouvellement évoluée capable de croître plus rapidement dans un milieu de culture ne contenant que l acide cyanurique comme source d azote. Cette population est caractérisée par une délétion d une région de 47 kb du plasmide ADP1 contenant les gènes atzABC. Les analyses conduites ont permis de conclure que le gain de compétitivité de la population évoluée résidait dans la perte du fardeau génétique représenté par la région de 47 kb, la capacité de dégradation de l acide cyanurique restant inchangée. (ii) L exposition à l atrazine a conduit à la sélection d une populationnouvellement évoluée caractérisée par l insertion du plasmide ADP1 en quasi-totalité sur le chromosome bactérien. [...] Le troisième volet a consisté à développer un outil permettant d évaluer, à l échelle d une communauté microbienne synthétique, l évolution du potentiel génétique dégradant. Pour ce faire quatre souches dégradantes dont une, Arthrobacter sp. TES6, isolée au cours de cette étude, ont été choisies. [...] Ces travaux montrent que la fonction de biodégradation accélérée de l atrazine est très versatile et qu elle est en constante évolution. Il met en évidence que le principal facteur pilotant cette évolution est le niveau d exposition des populations dégradantes au pesticide.Atrazine, one of the most used herbicide to control the development of weeds in crop, has led to the contamination of the environment. Repeated exposure to this herbicide resulted in the emergence of microbial populations able to degrade atrazine and to use it as a nitrogen source for its growth. These microbial populations are responsible for accelerated biodegradation of atrazine (BDA), a key ecosystemic service diminishing the persistence of this herbicide in the environment. The aim of this PhD work was to study genetic and physiological mechanisms responsible for functioning and improving of this ecosystemic service. We applied an experimental approach starting from genes to communities degrading atrazine in order to identify processes of adaptation involved in the evolution of accelerated biodegradation function.The first part of the PhD aimed at evaluating the importance of accumulation of single mutations in the atzA gene for the activity of AtzA transforming atrazine to hydroxyatrazine. Sequencing or atzA genes amplified from different atrazine-degrading isolates (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps and differents Chelatobacter heintzii) showed that atzA sequence was conserved. However, four non synonymous mutations were identified (1 for Pseudomonas sp. ADP Ps and 3 for Chelatobacter heintzii). Modeling of AtzA structure showed that three mutations were located in important regions (active site, interaction with atrazine and with the metal Fe2+). [...] The second part aimed at studying the plasticity of the atrazine-degrading pathway in two opposed conditions: (i) one aiming at evaluating the persistence of degrading capability in absence of selection pressure and (ii) a second one aiming at evaluating the evolution of degrading capability under high selection pressure exerted by atrazine. With these aims, experimental evolutions were carried out with Pseudomonas sp. ADP. (i) We showed that cyanuric acid exposure led to the selection of a newly-evolved population characterized by increased growing ability on culture medium containing this substance as nitrogen source. This population is characterized by the deletion of a 47 kb region containing atzABC genes from ADP1. We showed that increased fitness of newly-evolved population was due to the selective loss of the genetic burden represented by the 47 kb region, the cyanuric acid degrading ability remaining unchanged. (ii) Atrazine exposure led to the selection of population characterized by the insertion of ADP1 plasmid in the bacterial chromosome. [...] The third part aimed at developing a tool allowing monitoring the evolution of atrazine-degrading genetic potential at the scale of a synthetic microbial community. To do so four degrading strains among which, one was isolated in this study, were chosen. [...] Altogether, these results showed that the atrazine accelerated biodegradation function is highly versatile and under constant evolution. Furthermore, they highlight that the exposure to atrazine is the key parameter driving the evolution of degrading populationDIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

Isoproturon

L usage répété d isoproturon (IPU) en agriculture pour contrôler développement de plantes adventices dans les cultures céréalières a non seulement abouti à la contamination du sol et des ressources en eaux mais également à l adaptation de la microflore du sol à la dégradation accélérée de cet herbicide appartenant à la famille des phénylurées. A l heure actuelle, les mécanismes microbiens impliqués dans cette adaptation ne sont pas encore parfaitement élucidés. Dans ce contexte, l objectif de cette étude était d explorer les processus et les facteurs impliqués dans la biodégradation de l isoproturon, et ce, depuis l échelle agricole de la parcelle jusqu à celle des gènes codant cette fonction dans des populations microbienne dégradantes.L étude réalisée à partir d une parcelle expérimentale du domaine d Epoisses, cultivée selon une rotation blé d hiver/ orge / colza, a montré que, suite à l usage répété d IPU, la microflore du sol s était adaptée à sa minéralisation. Des analyses réalisées à l aide d outils statistiques et géostatistiques ont révélé l existence d une variabilité spatiale de la minéralisation de l IPU au sein de la parcelle agricole. Celle-ci s est révélée être non seulement corrélée avec différents caractéristiques physicochimiques du sol (C/N, CEC, ) mais également avec le plan d épandage des pesticides au cours de la rotation culturale.Afin de mieux étudier les mécanismes moléculaires responsables de la minéralisation de l IPU, une culture bactérienne ainsi qu une souche (Sphingomonas sp. SH) minéralisant l IPU ont été isolées par enrichissement à partir de deux sols différents, tous deux adaptés à la biodégradation accélérée de l IPU. La culture bactérienne et la souche pure ont toutes deux montré un métabolisme spécifique pour la dégradation de l IPU, étant capables de dégrader l IPU et ses principaux métabolites mais aucun des autres herbicides de la famille des phénylurées. La culture bactérienne et la souche présentaient une activité dégradante optimale à pH7,5 et étaient affectées par des pH inférieurs et supérieurs à cette valeur optimale. Sur la base des métabolites accumulés lors de la dégradation de l IPU, nous avons proposé que l IPU serait dégradé par deux déméthylations successives, suivi par la coupure de la chaine urée aboutissant à l accumulation de 4-isopropylaniline, et finalement la minéralisation du cycle phényl.Afin d identifier les gènes impliqués dans la minéralisation de l IPU, une banque de clones BAC a été réalisée à partir de l ADN génomique purifié de la culture bactérienne. Bien que le crible fonctionnel réalisé n a pas permis d identifier de BAC capable de dégrader l IPU ou l un de ses métabolites, un criblage moléculaire par PCR ciblant la séquence catA codant la catéchol 1,2-dioxygénase, nous a permis d identifier trois BACs. Le pyroséquençage des ces 3 BACs et l agrégation des séquences correspondantes ont permis d identifier un fragment génomique de 33 kb présentant notamment l opéron cat impliqué dans le clivage ortho du cycle phényl du catéchol. De ce fait nous avons émis l hypothèse selon laquelle la 4-isopropylaniline formée lors de la dégradation de l IPU pourrait être minéralisée par le clivage ortho du catéchol, un intermédiaire clef de la voie des beta-kétoadipates. Ceci nous a donc permis de proposer une voie métabolique pour la voie basse de la dégradation de l IPU qui, jusqu alors, n avait pas encore été décrite.Frequent use of phenylurea herbicide isoproturon (IPU) in agricultural fields has resulted not only in the contamination of the natural resources including soil and water but also in the adaptation of the soil microflora to its rapid degradation. However, up to now, the mechanisms underlying this microbial adaptation are not well elucidated. The aim of this study was to explore the processes and factors implicated in IPU degradation from the agricultural field to the genes coding for catabolic genes. The study carried out at the experimental field of Epoisses cropped with a winter wheat / barley / rape seed crop rotation indicated that as a result of its periodically repeated use, the soil microflora adapted to IPU mineralization activity. Further analysis using exploratory and geostatistical tools demonstrated the existence of spatial variability in IPU mineralization activity at the field scale which was correlated not only with several soil physico-chemical parameters like organic matter content, CEC and C/N ratio but also with the pesticide application plan over a three year crop rotation. In order to get further insight into underlying mechanisms, an IPU mineralizing bacterial culture and strain Sphingomonas sp. SH were isolated through enrichment cultures performed from two different adapted soils. Both had the catabolic activities highly specific for the mineralization of IPU and its metabolites but none of other structurally related phenylurea herbicides. IPU metabolic activity of both the mixed culture and the strain SH was found to be affected by pH with optimal activity taking place at pH 7.5. Based on the accumulation of different known metabolites during mineralization kinetics, IPU metabolic pathway was proposed to be initiated by two successive demethylations, followed by cleavage of the urea side chain resulting in the accumulation of 4-isopropylaniline, and ultimately the mineralization of the phenyl ring. In order to identify the genes involved in IPU degradation, BAC clone library was established from the genomic DNA of the bacterial culture. Although, the functional screening did not yield in identifying any BAC clone able to degrade IPU or its known metabolites, the PCR based screening led us to identify a cat gene cluster involved in ortho-cleavage of the phenyl ring of catechol through beta-ketoadipate pathway. Based on this finding, it was hypothesized that phenyl ring of 4-isopropylaniline formed during IPU transformation might be mineralized through ortho-cleavage of catechol. This finding allowed us to propose the lower IPU metabolic pathway which was not yet described.DIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

Amélioration de la compétitivité d’une population bactérienne dégradant l’atrazine, liée à une perte de gènes

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Influence de la biodégradation dans l'atténuation des pesticides sur un bassin versant viticole : potentialité des différents éléments du paysage et rôle des zones tampons

Session 1 - Des usages aux impacts : les indicateurs EA EcolDurNos travaux réalisés sur le bassin viticole de la Morcille ont montré que les différents compartiments du paysage (sol de la parcelle, bande enherbée et sédiments) présentaient une aptitude à minéraliser le diuron. La capacité épuratrice de ces différents compartiments évolue en fonction du niveau d'exposition au contaminant. L'importance du flux érosif de la parcelle viticole vers le cours d'eau pour l'adaptation des communautés microbiennes à la biodégradation du diuron a pu être mise en évidence. Ainsi, bien que la microflore des sédiments présente intrinsèquement la capacité à s'adapter à la biodégradation du diuron, cette faculté est améliorée par le flux érosif, suggérant le transfert du potentiel épurateur du compartiment terrestre au compartiment aquatique. L'évolution de la capacité épuratrice des sédiments de la Morcille en réponse à l'interdiction d'usage du diuron a permis de mettre en évidence l'amélioration de la qualité chimique des eaux et la diminution des capacités épuratrices des sédiments de la rivière. Des populations microbiennes appartenant au genre Arthrobacter transformant le diuron en 3,4-dichloroaniline ont été isolées du sol de la zone tampon et des sédiments. Un isolat bactérien appartenant au genre Achromobacter dégradant la 3,4-dichloroaniline a été isolé. Le consortium synthétique formé d'Arthrobacter sp. et d'Achromobacter sp. minéralise le diuron. Ces résultats suggèrent que la communauté bactérienne minéralisant le diuron dans le sol de la zone tampon et dans les sédiments repose sur la coopération métabolique de ces deux populations

Mécanismes d'évolution de pseudomonas sp. adp sous pression de sélection exercée par l'atrazine

L’atrazine est un pesticide qui est largement utilisé dans le monde depuis une quarantaine d’années. Son application répétée aaboutit non seulement à la contamination des eaux mais également à l’apparition de bactéries telluriques capables d’utiliserce xénobiotique comme source d’azote pour leur croissance. La caractérisation des gènes atz responsables de la dégradationde cette molécule a révélé qu’ils étaient largement dispersés et très conservés au sein du monde bactérien traduisant ainsid’une évolution et d’une dispersion récente de ces gènes, probablement concomitantes avec l’application d’atrazine dansl’environnemen

Physiological and genetic characterization of an isoproturon mineralizing bacterial strain isolated from a French agricultural soil: Genomic approach to search for isoproturon degrading genes

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