Progettazione, sintesi e valutazione dell'attività biologica di nuovi carbazoli

2008 - 2009Il presente lavoro di tesi è stato svolto presso il laboratorio di Fitofarmacia del Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università della Calabria e presso il Laboratorio di Farmacognosia dell’Università Paris Descartes di Parigi. L’attività di ricerca è stata dedicata alla sintesi di nuovi carbazoli concepiti come analoghi dello stilbene naturale combretastatina A-4 (CA-4) ed alla successiva valutazione dell’attività biologica in vitro dei composti ottenuti. Presso il Laboratorio di Farmacognosia dell’Università Paris Descartes erano stati già sintetizzati degli analoghi eterociclici della combretastatina A-4, dotati di buona attività biologica. Obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di sintetizzare analoghi dei composti precedentemente ottenuti, apportando ulteriori modifiche strutturali atte a migliorarne le proprietà biologiche, al fine di completare lo studio delle relazioni struttura-attività di questa serie di molecole. Nel corso dei precedenti lavori erano stati sintetizzati dei nuovi 3-aroilindoli, concepiti quali analoghi eterociclici della CA-4 e, successivamente, una serie di 5-(3’,4’,5’-trimetossifenil)pirrolo[3,4-a]carbazoli-1,3(2H,10H)-dioni, concepiti come analoghi cis-blocked dei 3-aroilindoli ed ariltioindoli ottenuti. Alcune di queste molecole avevano mostrato in vitro una buona attività biologica. Obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di sintetizzare nuovi carbazoli, analoghi « aperti » della precedente serie, in modo da ridurre l’ingombro sterico a livello dell’anello benzenico che caratterizzava i carbazoli ed i tetraidrocarbazoli già realizzati, al fine di ottenere dei composti che esplicassero una migliore attività biologica. Il progetto di ricerca ha previsto inizialmente la sintesi di una prima serie di molecole realizzata a partire dall’indolo non sostituito, concepita come modello sperimentale. Per la sintesi delle molecole è stata impiegata una procedura descritta da Noland e collaboratori nel 1996, con qualche opportuna modifica. La realizzazione di questa prima serie di molecole è stata fondamentale, poiché ha consentito di mettere a punto percorsi di sintesi adeguati alla realizzazione di molecole più complesse. Una seconda serie di molecole è stata infatti realizzata, successivamente, a partire dal 6-metossindolo, al fine di ottenere, sulla base di relazioni struttura-attività note, molecole dotate di attività biologica superiore a quella mostrata dalle molecole della prima serie non sostituite. Nel corso del lavoro di tesi sono stati dunque sintetizzati nuovi trimetossifenil-pirroloindolocarbazoli a partire dall’indolo semplice e, in seguito, una seconda serie di molecole a partire dal 6-metossindolo. Molti tentativi sono stati compiuti al fine di ottenere molecole non benzilate sull’anello della maleimide, che fossero caratterizzate da un minor ingombro sterico, ma gli esperimenti non hanno condotto ai risultati attesi. Tale obiettivo è stato raggiunto, infine, realizzando le medesime procedure di sintesi a partire dal 6-bromoindolo: è stato possibile così sintetizzare nuovi composti a partire direttamente dalla maleimide anziché dalla N-benzilmaleimide, e che presentano pertanto un anello aromatico in meno rispetto ai precedenti analoghi. Al fine di valutare la potenziale attività antitumorale legata a proprietà antivascolari delle molecole sintetizzate, si è provveduto alla determinazione della citotossicità in vitro ed alla valutazione degli effetti inibitori sulla polimerizzazione della tubulina. In uno screening iniziale, l’attività antiproliferativa delle molecole sintetizzate è stata testata sulla linea cellulare tumorale B16 (cellule di melanoma murino), mediante il saggio in vitro MTT. Il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) è un saggio colorimetrico ampiamente utilizzato, che permette di misurare la proliferazione e la vitalità cellulare attraverso la valutazione dell'efficienza mitocondriale. La capacità delle molecole di inibire la polimerizzazione della tubulina è stata valutata, invece, utilizzando il colorante fluorescente DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole), impiegando con qualche opportuna modifica la procedura descritta da Barron et al. nel 2003 e da Bane e collaboratori nel 2007. Il colorante degli acidi nucleici DAPI subisce delle modificazioni in termini di fluorescenza in seguito al legame con la tubulina e all’assemblaggio dei monomeri, e le variazioni nell’intensità dell’emissione possono essere impiegati per monitorare la polimerizzazione della proteina. Per completare la valutazione dell’attività biologica dei composti ottenuti sono stati valutati, inoltre, gli effetti sulla morfologia delle cellule endoteliali Ea.hy 926, test considerato predittivo di una potenziale attività antivascolare in vivo. I risultati ottenuti hanno consentito di orientare il lavoro di sintesi e di evidenziare le relazioni struttura-attività per le serie di molecole realizzate. L’analisi dell’attività biologica delle molecole sostituite (serie R=OCH3) ha evidenziato ottimi risultati preliminari, coerentemente a quanto da noi ipotizzato sulla base delle relazioni struttura-attività note. Queste molecole sembrerebbero promettenti, infatti, sia per quanto concerne gli effetti sulla morfologia delle cellule endoteliali, sia per quanto riguarda l’attività inibitoria sulla polimerizzazione della tubulina. Ottimi risultati sono stati osservati per gli analoghi appartenenti alla serie R=Br, sia per quanto concerne gli effetti antiproliferativi, sia per quanto riguarda gli effetti sulla morfologia delle cellule endoteliali Ea.hy 926. Durante l’ultima parte del lavoro sperimentale, l’attività di ricerca è stata dedicata alla sintesi di nuovi diindolilmetani. I diindolilmetani ed i loro derivati costituiscono un’importante classe di composti eterociclici impiegati dall’industria farmaceutica. Queste molecole sono presenti nelle piante appartenenti alla famiglia delle Cruciferae, e sono note per la loro capacità di promuovere il metabolismo degli estrogeni e di indurre apoptosi in cellule tumorali umane. Allo scopo di sintetizzare nuovi carbazoli che fossero caratterizzati da un minor ingombro sterico, la procedura generale impiegata per la sintesi dei tetraidrocarbazoli è stata applicata utilizzando diversi prodotti di partenza. Queste reazioni non hanno condotto alla sintesi di nuovi carbazoli, ma è stato possibile, tuttavia, osservare la formazione di un nuovo diindolilmetano. Obiettivo seguente è stato dunque quello di migliorare la strategia di sintesi utilizzando una procedura più opportuna, in modo da aumentare le rese di reazione. Nelle fasi successive si è inteso appurare se la stessa procedura potesse essere applicata anche alla sintesi di diindolilmetani sostituiti. L’attività antiproliferativa delle molecole è stata testata su diverse linee cellulari tumorali umane mediante il saggio in vitro MTT. Sono state impiegate, in particolare, due linee cellulari di tumore mammario, MCF-7 (human breast cancer, ormono-dipendente) ed SKBR3 (human breast cancer, ormono-indipendente), ed una linea di tumore prostatico, LNCaP (human prostatic adenocarcinoma). In una seconda fase della valutazione dell’attività biologica si è inteso verificare se l’attività antiproliferativa fosse correlata ad induzione di apoptosi. [a cura dell'Autore]VIII n.s

Potential use in the treatment of inflammatory disorders and obesity of selected wild edible plants from Calabria region (Southern Italy)

Abstract The potential role of plants and their metabolites has been recently considered in the search for new well-tolerated anti-arthritic and anti-obesity drugs. This study was designed to assess the potential effectiveness of the methanolic extracts from four wild edible species from Southern Italy, Asparagus officinalis L., Bellis perennis L., Daucus carota L. and Sambucus nigra L. All these plants have a history as anti-rheumatic or anti-arthritic remedies. The chemical constituents were identified through GC–MS and HPTLC analyses and the in vitro antioxidant activity was determined by means of DPPH, ABTS, FRAP-Ferrozine and β-carotene bleaching tests. To assess the anti-inflammatory and anti-arthritic potentials, the capacity to inhibit nitric oxide production in murine macrophage RAW 264.7 cells and protein denaturation was measured. The anti-obesity potential was determined by evaluating the ability of the sample to inhibit pancreatic lipase, a key enzyme for dietary fats absorption. The raw extract of D. carota showed the best inhibitory activity on NO production (IC50 = 45.1 ± 1.0 μg/mL), followed by B. perennis and A. officinalis (IC50 equal to 193.1 ± 3.2 μg/mL and 506.3 ± 5.1 μg/mL, respectively). D. carota induced also inhibitory effects against the heat-induced denaturation of bovine serum albumin (IC50 = 878.7 ± 19.09 μg/mL) and the best lipase inhibitory potential (IC50 = 1.63 ± 0.07 mg/mL). Our findings suggest that this species could be a potential effective therapeutic agent to treat inflammation and arthritis, supporting the traditional popular use of this plant

Cytotoxic properties of Marrubium globosum ssp. libanoticum and its bioactive components

Marrubium globosum Montbr. et Auch. ex Benth. ssp. libanoticum Boiss. (Lamiaceae) is a medicinal plant used in Lebanon for the treatment of inflammatory diseases, asthma, coughs and other pulmonary and urinary problems. The goal of our study was to assess the biological activity of M. globosum by testing different extracts of the aerial parts for their antiproliferative activity against human melanoma cells using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The chloroform fraction showed the greatest activity. The compounds isolated from the extracts were also tested: the mixture of (13 S)-9α,13α-epoxylabda-6β(19),16(15)-diol dilactone and (13 R)-9α,13α-epoxylabda-6β(19),16(15)-diol dilactone was the most active fraction, with an IC50 value of 29.2 ± 0.06 μg/mL

Chemical composition and protective effect of oregano (Origanum heracleoticum L.) ethanolic extract on oxidative damage and on inhibition of NO in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages.

The present study shows the chemical profile and the in vitro properties (antioxidant and inhibition of nitric oxide production) of the Origanum heracleoticum L. (Lamiaceae). The ethanolic extract of the aerial parts is characterized by terpenes and fatty acids. The extract, with high total phenol and flavonoid content, showed a significant radical-scavenging activity (IC(50) value of 12.8 μg/mL) using the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) test and an interesting antioxidant activity with the β-carotene bleaching test (IC(50) values of 12.9 and 14.1 μg/mL at 30 and 60 min of incubation, respectively). The test for the inhibition of NO production, performed using the murine monocytic macrophage RAW 264.7 cell line, showed that the extract had significant activity with an IC(50) value of 108.5 μg/mL. The cytotoxic effect of O. heracleoticum extract in presence of lipopolysaccharide (LPS) (1 μg/mL) was evaluated but found to be negligible

Quantitative determination of Amaryllidaceae alkaloids from Galanthus reginae-olgae subsp. vernalis and in vitro activities relevant for neurodegenerative diseases.

In the present work the qualitative and quantitative analysis of Amaryllidaceae-type alkaloids in the aerial parts and bulbs of Galanthus reginae-olgae Orph. subsp. vernalis Kamari is presented for the first time using GC-MS analysis. The alkaloids galanthamine, lycorine, and tazettine were identified in both extracts while crinine and neronine were found only in the bulbs. The yield of alkaloid fraction from bulbs (36.8%) is very high compared to the yield from aerial parts (9.34%). Lycorine was the major component in both fractions. The antioxidant potential was determined by three complementary methods. The preparations to reduce the stable free radical DPPH to the yellow-colored 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl with IC(50) values of 39 and 29 mug/mL for MeOH extracts from aerial parts and bulbs, respectively. The higher activity was given by EtOAc fraction of aerial parts with IC(50) of 10 mug/mL. This activity is probably due to the presence in EtOAc fraction of polar compounds such as polyphenols. The fraction exhibited a significant antioxidant capacity also in the beta-carotene-linoleic acid test system. A higher level of antioxidant activity was observed for EtOAc fraction from bulbs with IC(50) of 10 mug/mL after 30 min and 9 mug/mL after 60 min of incubation. In contrast, the fraction from bulbs performed poorly in the lipid peroxidation liposomes assay. Significant activity was obtained for dichloromethane fraction from aerial parts (IC(50) of 74 mug/mL). The major abundance of alkaloid in dichloromethane fraction may be responsible of the bulbs anti-cholinesterase highest activity (38.5%) at 0.5 mg/mL

Crocus cancellatus subsp. damascenus stigmas: chemical profile, and inhibition of α-amylase, α-glucosidase and lipase, key enzymes related to type 2 diabetes and obesity

Spices are appreciated for their medicinal properties besides their use as food adjuncts to enhance the sensory quality of food. In this study, Crocus cancellatus subsp. damascenus was investigated for its antioxidant activities employing different in vitro systems. Stigma extract demonstrated a radical scavenging activity against both 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) radicals with IC50 values of 34.6 and 21.6 µg/mL and a good ferric reducing ability (53.9 µM Fe(II)/g). In order to clarify the potential functional properties of this spice, the carbohydrate-hydrolysing enzymes and pancreatic lipase inhibitory properties were investigated. Crocus cancellatus subsp. damascenus extract inhibited α-amylase and α-glucosidase with IC50 values of 57.1 and 68.6 µg/mL, respectively. The bioactivity was discussed in terms of phytochemicals content. The obtained results may be of interest from a functional point of view or as food additive and to promote the revalorization of this species

Protective effect of Hypericum calabricum Sprengel on oxidative damage and its inhibition of nitric oxide in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages

The present study shows for the fi rst time the phenolic composition and the in vitro properties (antioxidant and inhibition of nitric oxide production) of Hypericum calabricum Sprengel collected in Italy. The content of hypericins (hypericin and pseudohypericin), hyperforin, fl avonoids (rutin, hyperoside, isoquercetrin, quercitrin, quercetin and biapigenin) and chlorogenic acid of H. calabricum, have been determined. The ethyl acetate fraction from the aerial parts of H. calabricum exhibited activity against the radical 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) with IC 50 value of 1.6 μg/ml. The test for inhibition of nitric oxide (NO) production was performed using the murine monocytic macrophage cell line RAW 264.7. The ethyl acetate fraction had signifi cant activity with an IC 50 value of 102 μg/ml and this might indicate that it would have an anti-infl ammatory effect in vivo

Antioxidant, enzyme-inhibitory and antitumor activity of the wild dietary plant Muscari comosum (L.) Mill.

Conventional medicines used to treat obesity and cancer frequently exhibit high side effects, so that researchers are focusing on new therapies and drugs based on natural products. Total extracts from bulbs of Muscari comosum were tested for i) free radical scavenging activity, ii) in vitro enzymatic inhibition of pancreatic α-amylase and lipase, and iii) inhibition of the growth of breast adenocarcinoma cells. Three treatments were considered: bulbs boiled in water for 15 min (traditional cooking method; BB); bulbs steam-cooked for 15 min (alternative cooking method; SB); raw bulbs (RB). The polyphenol content and antioxidant capacity of bulb extracts were related to the inhibition of pancreatic lipase and α-amylase, whose activities have been found to have a half maximal inhibitory concentration (IC50) of 0.28, 2.14 and 3.22 mg/mL for lipase, and 0.16, 0.73 and 0.69 mg/mL for α-amylase in RB, SB and BB, respectively. The analysis on breast adenocarcinoma MCF-7 cells revealed that RB extracts, and in a lesser extent BB, exerted a dose-dependent inhibition on cell proliferation. Considering that the potential of natural products for the treatment of obesity are under exploration, M. comosum could be an excellent plant for the development of future anti-obesity drugs, also able to prevent cancer

Cachrys libanotis L. Extracts: Photocytotoxic Effects on UVA-Irradiated Human Melanoma Cells

Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. Photochemotherapy, combining the action of a light source and a chemical photosensitizer, is one of the most interesting current therapeutic approaches. Plants represent a rich source of photoactive compounds, and furanocoumarins are some of the most important naturally occurring phytoconstituents. The aim of this study was to evaluate the photocytotoxic potential of Cachrys libanotis L. (Apiaceae) from Southern Italy. This species belongs to a genus rich in furanocoumarins and widely distributed in Europe. The aerial parts were extracted through both traditional maceration and pressurized cyclic solid-liquid (PCSL) extraction using Naviglio extractor®. Qualitative and quantitative analyses were performed to detect the coumarins content using GC-MS, and the photocytotoxic effects of the extracts were assessed on UVA-irradiated C32 melanoma cells. The apoptotic responses were also evaluated. Furthermore, phenolic content and the in vitro antioxidant potential were also estimated. Xanthotoxin, bergapten and isopimpinellin were identified and quantified. Both extracts affected cell viability in a concentration-dependent manner after irradiation for 1 hour at a dose of 1.08 J/cm2. Sample obtained through PCSL extraction was the most effective, with an IC50 equal to 3.16 μg/mL, a very interesting value if compared with the positive control bergapten. This extract induced up-regulation of apoptotic signals such as BAX and PARP cleavage and, in the presence of UVA radiation, it caused a greater upregulation of p21 protein. Obtained results suggest that investigated species could be a good candidate for further studies aimed to find new drugs with photocytotoxic potential

Essential Oils and Bioactive Components against Arthritis: A Novel Perspective on Their Therapeutic Potential

Essential oils (EOs) are known to possess a number of beneficial properties. Their antimicrobial, anti-inflammatory, antioxidant, antidiabetic, and cancer-preventing activities have been extensively reported. Due to their wide use as food preservers and additives, as well as their use in agriculture, perfumes, and make-up products, these complex mixtures of volatile compounds have gained importance from a commercial point of view, not only in the pharmaceutical industry, but also in agronomic, food, cosmetic, and perfume industries. An analysis of the recent scientific literature allowed us to highlight the presence of an increasing number of studies on the potential antiarthritic properties of EOs and their main constituents, which seems to suggest a new interesting potential therapeutic application. The aim of this review is to examine the current knowledge on the beneficial effects of essential oils in the treatment of arthritic diseases, providing an overview of the reports on the in vivo and in vitro effects of EOs. Furthermore, this review critically examines the recent findings on the potential roles of the main components of EOs in the exerted beneficial effects. Obtained negative results are also reported