The immunoregulatory effect of dichloroacetate in human CD4+ T-cells

Today, kidney transplantation is considered to be the most widespread treatment for end-stage renal failure. However, the development of novel, more effective and safer immunosuppressants is considered essential given the serious complications of renal transplanted patients.Recent research has been focused on investigating substances that interfere with the metabolism of allogeneic CD4+ T cells, inhibit aerobic glycolysis and direct their differentiation to Tregs instead of Teffs. The latter are the main mediators of rejection of allogenic grafts whereas, on the contrary, Tregs have been shown to contribute to graft tolerance. In this context, dichloroacetic acid (DCA) is a drug that inhibits aerobic glycolysis and is already used in the treatment of hereditary lactic acidosis without side effects. The aim of this PhD dissertation was to investigate the potential immunomodulatory effect of DCA focusing on the metabolism of allogeneic CD4+ T-lymphocytes and their differentiation into effector or regulatory subsets.In this context, two-way mixed lymphocyte reaction (MLR) was used as a model of alloreactivity. Initially, in order to study the effect of DCA on the metabolic pathway of aerobic glycolysis, both glucose consumption and lactic acid production were measured in the supernatant of cell cultures. Moreover, the effect of the drug on cell proliferation was assessed with 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) immunostaining. In addition to this, human alloreactive CD4+ T-cells of each MLR were isolated using negative magnetic separation and the effect of DCA on the relative protein expression of: (a) transporters and enzymes involved in glycolysis; (b) cleaved caspase-3, marker of cellular apoptosis; and c) transcriptional markers that characterize the differentiation of CD4+ T lymphocytes to effector or regulatory subsets, was assessed by Western blotting.The results of our experiments showed that in MLRs, DCA reduced glucose consumption and aerobic glycolysis while having a negligible effect on cell proliferation. In addition, with respect to human alloreactive CD4+ T-lymphocytes isolated from MLRs, DCA:a) reduced the protein expression of the glucose receptor GLUT1, hexokinase II, lactate dehydrogenase A and phosphorylated pyruvate dehydrogenase, while increasing total pyruvate dehydrogenase.b) increased the protein expression levels of cleaved (activated) caspase-3c) increased the protein expression levels of FoxP3, a transcriptional factor and lineage marker of CD4+ Tregs, while reducing expression of RORγt, GATA-3 and T-bet transcription factors and markers of differentiation of CD4+ T-lymphocytes to effector Th17, Th2 and Th1 subspecies, respectively.Summarizing, in alloreactive CD4+ T lymphocytes, DCA inhibits aerobic glycolysis, induces cell apoptosis and favors differentiation into Tregs. The above data, couple with the fact that DCA is already used in clinical practice, rendering it a promising immunosuppressive drug in the field of solid organ transplantation.Σήμερα, η μεταμόσχευση νεφρού θεωρείται η πιο διαδεδομένη θεραπεία για τη νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου. Ωστόσο, η ανάπτυξη νέων αποτελεσματικότερων και ασφαλέστερων ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων θεωρείται αναγκαία, δεδομένων των σοβαρών επιπλοκών που εμφανίζονται στους μεταμοσχευμένους νεφροπαθείς.Έρευνες των τελευταίων ετών προσανατολίζονται στην διερεύνηση ουσιών που παρεμβαίνουν στο μεταβολισμό των αλλοδραστικών CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων, με το να αναστέλλουν την αερόβια γλυκόλυση, επιτυγχάνοντας τελικά τη στοχευμένη διαφοροποίησή τους προς ρυθμιστικά (Tregs) έναντι των εκτελεστικών (Teffs). Τα τελευταία, μάλιστα, αποτελούν τους κύριους μεσολαβητές της απόρριψης αλλογενών μοσχευμάτων. Αντίθετα, τα ρυθμιστικά συμβάλλουν στην ανοχή του μοσχεύματος. Στο πλαίσιο αυτό, το διχλωροξικό οξύ (DCA) είναι ένα φάρμακο που επηρεάζει τον κυτταρικό μεταβολισμό. Πιο συγκεκριμένα, ο εν λόγω παράγοντας παρεμποδίζει την αερόβια γλυκόλυση, ενώ ήδη χρησιμοποιείται κλινικά στη θεραπεία της κληρονομικής γαλακτικής οξέωσης χωρίς παρενέργειες. Σκοπός, λοιπόν, της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί η πιθανή επίδραση του DCA στα ανθρώπινα αλλοδραστικά CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα και συγκεκριμένα στη διαφοροποίησή τους προς Tregs ή Teffs, μέσω παρέμβασης στον μεταβολισμό τους.Για την επίτευξη του παραπάνω στόχου, χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο άλλο-ανοσοαντίδρασης η αμφίδρομη μεικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR) η οποία προσομοιάζει τις in vivo συνθήκες. Αρχικά, για τη μελέτη της επίδρασης του DCA στο μεταβολικό μονοπάτι της αερόβιας γλυκόλυσης υπολογίστηκε η κατανάλωση γλυκόζης και η παραγωγή γαλακτικού οξέος στο υπερκείμενο των κυτταροκαλλιεργειών. Η επίδραση του φαρμάκου στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό εκτιμήθηκε ανοσοενζυμικά με τη χρήση βρωμο-δεοξυ-ουριδίνης. Κατόπιν, ανθρώπινα αλλοδραστικά CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν με χρήση αρνητικού διαχωρισμού σε στήλες από κάθε MLR. Σε αυτά, με τη διαδικασία της ανοσοαποτύπωσης κατά Western, εκτιμήθηκε η επίδραση του DCA στην σχετική πρωτεϊνική έκφραση: α) μεταφορέων και ενζύμων που εμπλέκονται στην γλυκόλυση, β) δεικτών της κυτταρικής απόπτωσης και γ) μεταγραφικών παραγόντων-δεικτών διαφοροποίησης των CD4+ T λεμφοκυττάρων προς Tregs ή Teffs.Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι συνολικά στις MLRs, το DCA μείωσε την κατανάλωση γλυκόζης και την παραγωγή γαλακτικού οξέος, ενώ άσκησε αμελητέα επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ειδικότερα, στα ανθρώπινα αλλοδραστικά CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν από τις MLRs, το DCA:α) μείωσε την πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα-μεταφορέα της γλυκόζης GLUT1, της εξοκινάσης II, της γαλακτικής δεϋδρογενάσης Α και της φωσφορυλιωμένης πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης, ενώ συγχρόνως αύξησε την ολική πυροσταφυλική αφυδρογονάση,β) αύξησε τα επίπεδα έκφρασης της ματισμένης (ενεργοποιημένης) κασπάσης-3 καιγ) αύξησε τα επίπεδα έκφρασης του FoxP3, μεταγραφικού παράγοντα-δείκτη των Tregs, μειώνοντας ταυτόχρονα την έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων RORγt, GATA-3 και T-bet που αποτελούν δείκτες διαφοροποίησης των εκτελεστικών υποειδών Th17, Th2 και Th1. Συνοψίζοντας, το DCA αναστέλλει την αερόβια γλυκόλυση, προκαλεί κυτταρική απόπτωση και ευνοεί την διαφοροποίηση των ανθρώπινων αλλοδραστικών CD4+ Τ λεμφοκυττάρων προς Τregs. Τα παραπάνω δεδομένα, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι το DCA χρησιμοποιείται ήδη στη κλινική πράξη, το καθιστούν ένα πολλά υποσχόμενο ανοσοκατασταλτικό φάρμακο στον τομέα των μεταμοσχεύσεων συμπαγών οργάνων