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    Characterization of the unfolding mechanism of β -trypsin

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    O desdobramento no equilíbrio para a β-tripsina, induzido por desnaturação térmica, foi caracterizado termodinamicamente. O desdobramento foi acompanhado através de absorção no ultravioleta (UV) e espectroscopia de dicroísmo circular (DC) no UV próximo e distante. Além disso, experimentos utilizando a técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizados. As curvas de transição térmica foram reversíveis mostrando um desdobramento altamente cooperativo, e os dados experimentais foram bem ajustados à um modelo de transição de dois-estados, para o desdobramento dessa proteína. O gráfico da fração desnaturada versus temperatura, calculado a partir das curvas de desnaturação térmica, em diferentes comprimentos de onda, mostra coincidência dessas curvas. Além disso, a razão entre a entalpia de desnaturação calorimétrica e a entalpia de van ́t Hoff, obtidas por DSC, é próxima à unidade, o que suporta o modelo de dois-estados. O espectro de DC da enzima nativa foi registrado na faixa espectral de 184 a 260 nm e utilizado para se estimar as porcentagens dos elementos da estrutura secundária, pelos métodos VARSCL e SELCON. A estimativa da estrutura secundária, em solução, correspondeu aos resultados de difração de raios-X. As mudanças na estrutura da β-tripsina, resultante de desnaturação por calor e por uréia foram monitoradas por meio de espectroscopia de DC no UV próximo e distante. A quantidade dos vários elementos de estrutura secundária foi estimada para essas mudanças espectrais, através dos espectros no UV distante, utilizando o método CCA (“Convex Constraint Algorithm”). De acordo com as estimativas, os estados desdobrados para essa proteína, ou seja, a 70 o C e em uréia 2,6 M, apresentaram quantidades consideráveis de estrutura secundária regular. Os espectros de fluorescência intrínsica dos resíduos de triptofano, registrados em diferentes concentrações de uréia, mostram a presença de um estado intermediário no equilíbrio, que apresenta grande afinidade pela sonda bis-ANS. Além disso, a ausência de contatos terciários e a presença de estrutura secundária para esse estado, verificados por meio de espectros de DC no UV próximo e distante, são consistentes com as características de um molten globule. As mudanças na atividade da β-tripsina foram observadas em concentrações de uréia nas quais não foram visualizadas nenhuma alteração espectroscópica da estrutura terciária da proteína. Os parâmetros cinéticos, k cat e K M , determinados na ausência e na presença de uréia, mostraram que o decréscimo na atividade da enzima, em baixas concentrações de uréia, foi provavelmente devido à formação do complexo EI, formado entre a β-tripsina e a uréia, um inibidor competitivo dessa enzima.The unfolding equilibrium of β-trypsin induced by thermal denaturation was thermodynamically characterized. Thermal unfolding equilibrium were monitored using UV absorption and both far- and near-UV CD spectroscopy. In addition, experiments using differential scanning calorimetry (DSC), were performed. Thermal transition curves showed to be reversible and cooperative, and the data could be reasonably fitted using a two-state model for the unfolding of this protein. Plots of the fraction denatured, calculated from thermal denaturation curves at different wavelengths, versus temperature were coincident. In addition, the ratio of the enthalpy of denaturation obtained by scanning calorimetry to the van ́t Hoff enthalpy was close to one, which supports the two-state model. The dichroism circular (CD) spectrum of the native protein was taken over the wavelength range of 184- 260 nm, and the amount of various secondary structures were estimated using VARSLC and SELCON methods. The CD estimation of secondary strucutre, showed excellent agreement with X-ray results. The CD spectra of β-trypsin, as a function of temperature and urea, were monitored by far- and near-UV CD, and the relative proportions of secondary structures calculated by CCA method. According to CD estimation, although the secondary structure changed upon denaturation, its denatured state still has considerable amounts of ordered structure. The intrinsic fluorescence emission spectra of β-trypsin, at different urea concentration, showed an intermediate equilibrium state, with great affinity by bis-ANS. Besides, the absence of terciary contacts and the presence of secondary structure for this state, are consistent with the molten globule characteristics. Changes on the activity of β-trypsin were observed at urea concentrations in which terciary structure changes were not detected. Kinetic parameters, k cat and K M , determined in the presence and absence of urea, showed that the decreases in enzyme activity, at low concentrations of urea, were probably due to a development of the enzyme-inhibitor complex between β-trypsin and urea, a competitive inhibitor of this enzyme

    Caracterização bioquímica e cinética de lipoxigenases de folhas de soja submetidas à remoção dos primórdios florais Biochemical and kinetic characterization of lipoxygenases from soybean leaves submitted to the removal of floral primordial

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    O uso da soja [Glycine max (L.) Merrill] na alimentação humana tem encontrado dificuldades devido ao seu sabor característico (beany flavor), que é derivado da ação das lipoxigenases (EC 1.13.11.12). Ao contrário das lipoxigenases de sementes de soja, que têm sido extensivamente estudadas, a diversidade e características das lipoxigenases de folhas não estão totalmente elucidadas. Sabe-se que além de sua atividade catalítica, as lipoxigenases de folhas estão envolvidas no armazenamento temporário de nitrogênio e na resposta da planta ao estresse. Com o objetivo de investigar o efeito da remoção dos primórdios florais na atividade das lipoxigenases de folhas de soja, foram utilizados dois genótipos de soja: IAC-100, uma variedade com presença de lipoxigenases na semente e IAC-100 TN, uma linhagem com ausência completa de lipoxigenases na semente. Por meio de dados da cinética enzimática, foram constatados dois picos mais acentuados de atividade em pH 5,0 e 6,5, com temperatura ótima de 25ºC. Para ambos os genótipos, as atividades foram maiores nos tratamentos que nos respectivos controles. Os valores de KM app aos 16 dias, nas plantas-controle, foram semelhantes para os dois genótipos, sugerindo não haver influência da manipulação genética das lipoxigenases na semente em relação à expressão dos genes que codificam as lipoxigenases de folhas. No entanto, os valores de KM app foram diferentes entre a fase vegetativa e a reprodutiva, em ambos genótipos, indicando pools distintos de isoenzimas lipoxigenases entre as duas fases.The use of soybean [Glycine max (L.) Merrill] as human food has been encountered difficulties due to beany flavor. The beany flavour is originated from lipoxygenases (EC 1.13.11.12). Soybean seed lipoxygenases have been extensively studied, however, the diversity and characteristics of lipoxygenases present in leaves are still being studied. Besides its catalytic activity, lipoxygenases from soybean leaves have been implicated in temporary nitrogen storage and response to stress. The primary objective of this research was to investigate the effect of floral primordial elimination (sink deprivation) on soybean leaves lipoxygenases activity. Two different genotypes differing in the presence (IAC-100) or absence (IAC-100 TN) of LOX in their seeds were used. The enzymatic kinetics analysis showed two pronounced peaks of activity at pH 5 and 6.5, with optimal temperature of 25ºC. The KM app values were similar for both genotypes suggesting that there was not effect of genetic manipulation of seeds lipoxygenases on genes expression that code for leave lipoxygenases. However, the KM app values were different between the vegetative and reproductive development stage, suggesting that there are differents pool of lipoxygenases between the two stages
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