Study and utilization of functional properties of mesenchymal stem cells from various sources

Lentiviral γ-globin vectors were initially introduced and are constantly beingimproved as a potentially efficient tool for thalassemia gene therapy. The choice of γ-gene as a therapeutic transgene is based on its anti-sickling effect and its ability topair with the α-globin chains, generating functional HbF. However, their use has oftenbeen hampered by low titers, variable expression and gene silencing. To addressthese issues, previous studies in our lab have successfully developed a series ofoncoretroviral vectors, containing the HPFH-2 enhancer combined with the -117activating Greek mutation of the Aγ-gene promoter and the HS-40 enhancer of the α-globin gene locus, that exhibited high level of Aγ-gene expression with absence ofsilencing. The purpose of this PhD thesis was to develop novel SIN (Self-Inactivating) lentiviral vectors carrying the afore-mentioned regulatory elements andto further evaluate them in a MEL-585 cell-line (Murine ErythroLeukemia- 585), aswell as to assess their therapeutic capacity both in vivo in a β-thalassemia mousemodel and in vitro using CD34+ hematopoietic progenitor cells from β-thalassemiahuman patients. The main goal of this study was to set the ground for a futuresuccessful clinical trial for β-thalassemia gene therapy.• Aim 1: Construction of SIN lentiviral vector GGHI and assessment of itstransduction efficiency in MEL-585 cell-line.In particular, the novel LCR-free, SIN γ-globin lentiviral vector (LV), designated asGGHI is a 3rd generation LV that carries an Aγ-globin gene driven by the Aγ promoterwith the -117 activating HPFH mutation in a reverse orientation relative to the HIVtranscription start site. The HPFH-2 and HS-40 enhancer elements are located at the3´ and the 5´ ends of the transgene, respectively. To reduce repressive chromosomalposition effects on vector expression and to diminish variegation in transgeneexpression, the full length cHS4 chromatin insulator was also included in the GGHIvector. GGHI virus was produced by transient co-transfection of HEK-293Tpackaging cell line with the 4-plasmid system and concentrated 100-fold byultracentrifugation.The MEL-585 cells were transduced with the concentrated virus atserial dilutions and following the induction with hemin and HMBA towards anerythroid phenotype, the functional titer was estimated by FACS. The assessment ofthe stability of GGHI was performed with Southern hybridization using radio-labelledprobe in genomic DNA isolated from transduced MEL-585 cells at serial dilutions.Furthermore, individual MEL clones tranduced at a MOI=1-100 were assessed for Aγ-Abstractxxxiiiglobin gene expression at protein level with FACS and at RNA level with Real TimePCR.Results of Aim 1: The mean functional titer of GGHI vector was calculated tobe 2×108 Transduction Units/ml (TU/ml), following 100-fold concentration withultracentrifugation. The proviral integration of GGHI was intact (10kb) with nodetectable rearrangements as documented in the genomic DNA of transduced MELcells at serial dillutions. GGHI is capable of inducing high levels of Aγ-globinexpression in a pancellular manner, as calculated by FACS analysis using an anti γ-globin antibody at 9 discrete MEL-585 clones, following induction towards anerythroid phenotype. The net mean fluorescence intensity (MFI) was calculated697±347.9, while there was no expression in undifferentiated cells. Also, RNA wasisolated from the above clones and was used to determine Aγ-globin expressionlevels. Our results show that GGHI can induce Aγ-globin expression at282.1±491.18% per copy of mouse α-globin with an average VCN/cell=1.52. Overall,GGHI can efficiently induce high levels of Aγ-globin, in an erythroid-specific andpancellular manner with no signs of rearrengements and in most casesindependently of integration site.• Aim 2 In vitro assessment of the therapeutic potential of GGHI lentiviral vectorat CD34+ haematopoietic progenitor cells isolated from thalassemic patients.Thalassemic CD34+ haematopoietic progenitor cells were isolated from BM orperipheral blood from human patients suffering from β-thalassemia (n=20). Thesecells were cultured in appropriate serum-free medium enriched with cytokines andthen divided into two subpopulations; one was transduced with vector GGHI at a MOI100 for 18 hours, whereas the second was mock-transduced and served as control.Post transduction, CD34+ cells were further cultured, either in semi-solidmethylcellulose medium for 15 days, in order to form BFUe colonies, or in liquiderythroid culture for 18 days so as to promote the differentiation towards a matureerythroblast stage. Ideal culture conditions that support erythroid differentiation anddo not interfere with the exogenous HbF expression were first monitored in normalCD34+ cells from BM or Cord Blood (CB). 15 to 20 individual BFUes per patient ineach experiment were analyzed by semiquantitative PCR using vector-specificprimers, so as to estimate the transduction efficiency and the mean VCN/cell.Furthermore, at liquid erythroid culure level, the differentiation of CD34+ cells wasestimated by: using antibodies against the erythroid marker Glycophorin A, while theproliferation rate and the orthochromatic erythroblasts counts were assessed onAbstractxxxivcytospins. HbF expression, at erythroid liquid culture was further assessed at proteinlevel by FACS, as the percentage of differentiated cells that express HbF and HighPressure Liquid Chromatography (HPLC) to measure HbF expression. Attranscription level Real Time-PCR was employed. Finally, FACS analysis usingantibody against Annexin-V was performed to estimate the percentage of apoptosisin erythroblasts transduced with GGHI from liquid cultures compared to mocktransduced cells.Results of aim 2:Typical yield from bone marrow contained 1-2 × 106 CD34+ cells, while the yield froman initial volume of 20ml of peripheral blood ranged from 104 to 4 × 105 CD34+ cells.At BFUe clonal level, GGHI vector shown to have a transduction efficiency of 40.3%and a mean VCN/ cell of 1.1 per patient. The in vitro model of human erythropoiesisrecapitulated efficiently the pattern of hemoglobin expression, which seemed to beassociated with the developmental stage of the originating primary source(26,7±19,9%) and was determined to be three times lower relative to the in vivopercentage (67.52±41.56%), as calculated with HPLC from thalassemic patients.Therefore, the increase in HbF and the concomitant phenotypical correctionobserved in erythroid cultures is exclusively due to GGHI vector and the exogenousexpression of HbF. A higher percentage of differentiated cells was measured inGGHI transduced cells compared to mock transduced (GGHI cells: 25.2%, Mock:14.5%, p=0.00077), as well as a higher proliferation rate on the 17th day of erythroiddifferentiation in liquid culture (GGHI cells: 200%, Mock: 32%). Moreover, correctedcells exhibited an increased HbF expression relative to mock-transduced cells as aaverage outcome of all patients, which were statistically significant both in the case ofF positive cells (%HbF: GGHI κύτταρα: 51.6%, Μάρτυρας: 47.3%, p=0.09) and theMFI (GGHI κύτταρα: 449, Μάρτυρας: 409.4, p=0.005). Cell lysates from liquidcultures from all experiments were subjected to HPLC and under the specifiedexperiment conditions, GGHI-transduced CD34+ cells exhibited high γ-globin chainsproduction compared to mock transduced control cells with a mean increase 32.9%(p=0.001) from all patients. This HbF increase in protein level was further confirmedin transcription level, where a 29.1 fold increase was observed in GGHI transducedcells versus mock. In addition, GGHI transduction of thalassemic CD34+ cells canresult in statistically significant decrease in apoptosis rate, characteristic ofthalassemia. More precisely, transduction with GGHI resulted in a 50% reduction ofapoptosis, as the mean MFI in control cells was 106.6 versus 50.2 in transducedcells (p=0.007) and a mean 27.2% reduction in the percentage of apoptotic cells(p=0.007). These data were also assessed separately for β+ and β0 patients. Overall,Abstractxxxvthese findings taken together, demonstrate that GGHI is a novel SIN lentiviral vectorcapable of inducing high levels of HbF, folowing transduction of CD34+ cells withaugmented transduction efficiency even at low VCN/cell. Also, the ability tosignificantly restore the thalassemic phenotype, providing new and promisingperspectives in the field of globin gene therapy• Aim 3: In vivo assessment of the therapeutic potential of GGHI LV in a β-thalassemia mouse model.Bone marrow (BM) cells isolated from a mouse model of β-thalassemia (th3/+) werecultured in appropriate medium supplemented with cytokines and then transducedwith GGHI at different MOIs 20, 50 and 100. In order to determine the transductionefficiency and the VCN/cell of GGHI at differents MOIs, transduced BM cells weresubsequently cultured in a methylcellulose medium supplemented with cytokines thatpromotes the formation of BFUe colonies. Prior to a successful conditioning regimenfor BM transplantation (BMT), various combinations of myelosuppressant (Bu,Busulphan) and immunosupressants (Cy, Cyclophosphamide, CsA, Cyclosporin)were evaluated, so as to confer phenotypical correction of mouse β-thalassemia.Post BMT, peripheral blood was collected at monthly time intervals from the recipientmice in order to determine levels of HbF with FACS and evaluate the correction ofhematological parameters and the morphology of erythrocytes on blood smear.Results of aim 3: GGHI vector is capable of transducing th3/+ BM cells with100% efficiency at a MOI=50 and a mean VCN/cell=1.1. The combination of Bu (totaldose of 80mg/kg) and Cy (200mg/kg) pre-BMT and CsA (250μg/kg/dose) post-BMTfor prophylaxis was shown to provide sufficient immunosuppression along with 56%engraftment, as calculated with PCR with vector-specific primers at BM isolated fromtranspanted mice (n=9). No toxic side effects were observed as serum creatininlevels were within normal range (n=7). A high but transient expression of HbF wasdocumented at 7-10 weeks post BMT in the peripheral blood of transplanted mice,with a mean value of 70% (n=15). This HbF expression was accompanied by acorrection at the hematological parameters ((HCT- th3/+: 25.3%, th3/+/GGHI: 32.4%,p=0.0025, RBC- th3/+: 6.54x106 cells/μl, th3/+/GGHI: 8.34 x106 cells/μl, p=0,0001,HGB- th3/+: 9.19 g/dl, th3/+/GGHI: 10.46 g/dl, p=0,01) and a phenotypical correctionat RBC morphology, as observed on stained blood smear. Therefore, GGHI vectorcan efficiently transduce th3/+ BM cells and ameliorate β-thalassemia in vivo, asdocumented by phenotypical improvement of RBC morphology and correction ofhematologic parameters. The transient expression, though suggests that additionalissues of low engraftment of long term repopulating hematopoietic stem cells in theAbstractxxxvispecific animal model need to be addressed before full correction of β-thalassemiacan be achievedΗ κατασκευή λεντιικών φορέων για την διόρθωση του θαλασσαιμικούφαινοτύπου, χρησιμοποιώντας το γ-γονίδιο της σφαιρίνης, αναπτύσσεται δυναμικάως ένα δυνητικά αποτελεσματικό εργαλείο θεραπείας των αιμοσφαιρινοπαθειών. Ηεπιλογή του γ-γονιδίου βασίζεται στην ισχυρή αντι-δρεπανοκυτταρική δράση της γ-σφαιρίνης και την ικανότητά της να συνδέεται με την α-σφαιρίνη για τον σχηματισμόHbF. Σημαντικό πρόβλημα στην κατασκευή των φορέων αυτών αποτελεί ο χαμηλόςτίτλος, η διακύμανση της έκφρασης του διαγονιδίου καθώς και η αποσιώπηση τουφορέα. Στα πλαίσια της αντιμετώπισης αυτών των προβλημάτων, προηγούμενεςμελέτες από το εργαστήριό μας χρησιμοποίησαν επιτυχώς τον ενισχυτή τηςκληρονομικής παραμονής της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης-2 (HPFH-2) σε συνδυασμόμε τον υποκινητή του Αγ-γονιδίου που περιείχε την -117 Eλληνική HPFH μετάλλαξηκαθώς και τον ενισχυτή HS-40 από τον γονιδιακό τόπο της α-σφαιρίνης, σε μια σειράογκορετροϊικών φορέων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ηκατασκευή αυτό-αδρανοποιούμενων (Self-Inactivating, SIN) λεντιικών φορέων οιοποίοι φέρουν τα ανωτέρω ρυθμιστικά στοιχεία και η περαιτέρω αξιολόγησή τους σεκυτταρική ερυθρολευχαιμική σειρά ποντικού (MEL-585), αλλά και του ελέγχου τηςθεραπευτικής ικανότητάς τους in vivo σε μοντέλο ποντικού β-θαλασσαιμίας αλλά καιin vitro σε ανθρώπινα θαλασσαιμικά αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ μεπεραιτέρω στόχο την κλινική εφαρμογή τους στη γονιδιακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας. Ειδικότερα:• Ειδικός στόχος 1: Κατασκευή του αυτο-αδρανοποιούμενου LV GGHI καιέλεγχος της ικανότητας μεταγωγής της κυτταρικής σειράς ποντικού MEL-585.O SIN λεντιικός φορέας (LV) GGHΙ (Papanikolaou et al., 2011) είναι, λεντιικόςφορέας 3ης γενιάς και περιέχει στο 5' άκρο της κασέτας έκφρασής του το Αγ-γονίδιομε τον υποκινητή του που φέρει την -117 Eλληνική HPFH μετάλλαξη, καθώς και τονενισχυτή HS-40, ενώ στο 3' άκρο περιλαμβάνει τον ενισχυτή HPFH-2. Επιπλέον,στην περιοχή 3' LTR περιλαμβάνει τον μονωτή χρωματίνης cHS4, για τηνεξασφάλιση ομοιογένειας έκφρασης ασχέτως θέσης ενσωμάτωσης. Για τηνπαρασκευή του LV, πραγματοποιήθηκε συνδιαμόλυνση με σύστημα 4 πλασμιδίων,σε κύτταρα συσκευασίας της κυτταρικής σειράς HEK-293T και αφού ο ιόςσυγκεντρώθηκε με υπερ-φυγοκέντρηση 100 φορές ακολούθησε μεταγωγή των MEL-585 κυττάρων με πολλαπλότητα μόλυνσης MOI= 1-100. Μετά από ερυθροειδικήεπαγωγή των MEL κυττάρων με αίμη και ΗΜΒΑ ακολούθησε τιτλοποίηση του ιού σεδιαφορετικές αραιώσεις με κυτταρομετρία ροής. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος τηςΠερίληψηxxviiiσταθερότητας του ιού με αποτύπωση κατά Southern με ραδιο-σημασμένο ανιχνευτήσε γενωμικό DNA που απομονώθηκε από τα MEL κύτταρα που είχαν μεταχθεί(transduced) με διαφορετικές αραιώσεις του GGHI φορέα. Σε επίπεδο ανεξάρτητωνκλώνων πραγματοποιήθηκε έλεγχος της έκφρασης του θεραπευτικού διαγονιδίου τηςγ-σφαιρίνης τόσο σε πρωτεϊνικό επίπεδο με κυτταρομετρία ροής, όσο και σε επίπεδομετάγραφου με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (RealTime- PCR).Αποτελέσματα Στόχου 1: Ο μέσος λειτουργικός τίτλος του φορέα GGHIυπολογίσθηκε σε 2×108 Μονάδες Μεταγωγής ανά ml (TU/ml) μετά από 100 φορέςσυγκέντρωση με υπερ-φυγοκέντρηση. Ο προϊός δεν παρουσιάζει σημείαανακατατάξεων, καθώς εντοπίστηκε να υπάρχει ολόκληρος (10 Kb) στο γενωμικόDNA που απομονώθηκε από MEL κύτταρα που είχαν μεταχθεί με διαφορετικέςαραιώσεις του GGHI φορέα. Ο GGHI είναι ικανός να επάγει υψηλά επίπεδαέκφρασης της γ-σφαιρίνης, όπως υπολογίσθηκε σε 9 ανεξάρτητους κλώνους MEL μεκυτταρομετρία ροής με συνολική καθαρή μέση ένταση φθορισμού (MFI-MeanFluorescent Intensity) 697.11 με τυπική απόκλιση ±347.9 μονάδες. Τα επίπεδα τηςέκφρασης της Αγ-σφαιρίνης σε επίπεδο RNA στους ίδιους κλώνους ύστερα απόερυθροειδική επαγωγή έδειξαν ότι ο φορέας GGHI μπορεί να επιτύχει έκφραση τηςAγ-σφαιρίνης σε ποσοστό 282.1% με τυπική απόκλιση ±491.2% ανά αντίγραφοέκφρασης του γονιδίου της α-σφαιρίνης του ποντικού. Τέλος, ο αριθμός τωναντιγράφων του φορέα GGHΙ ανά κύτταρο (VCN/κύτταρο), όπως υπολογίσθηκε μεPCR πραγματικού χρόνου για τους MEL-585 βρίσκεται μεταξύ των τιμών 0.65-3.11με μέσο όρο 1.52 VCN/κύτταρο. Συνεπώς, ο GGHI φορέας είναι ικανός να επάγειυψηλή έκφραση της γ-σφαιρίνης, με ιστοειδικό και παν-κυτταρικό τρόπο,ανεξαρτήτως της θέσης ενσωμάτωσης και χωρίς γενωμικές αναδιατάξεις.• Ειδικός στόχος 2: Αξιολόγηση της θεραπευτικής ικανότητας του GGHI LV invitro σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ από θαλασσαιμικούςασθενείς.Απομονώθηκαν θαλασσαιμικά αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ από δείγματαΜΟ ή ΠΑ ασθενών (n=20). Τα κύτταρα αυτά αφού καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλομέσο με κυτοκίνες, χωρίστηκαν σε δύο υποπληθυσμούς˙ στον ένανπραγματοποιήθηκε μεταγωγή με το φορέα GGHI, ενώ στον άλλο έγινε μεταγωγή μεψευδή (mock) ιϊκά σωμάτια, με πολλαπλότητα μόλυνσης MOI=100. Μετά από 18 hμεταγωγής, τα CD34+ κύτταρα καλλιεργήθηκαν περαιτέρω είτε σε ημι-σταθερό μέσομεθυλοκυτταρίνης για 15 ημέρες, με σκοπό τη δημιουργία ερυθροειδικών κλώνωνBFUe, είτε σε υγρές καλλιέργειες διαφοροποίησης ώριμων ερυθροβλαστών για 18Περίληψηxxixημέρες, αφού πρώτα είχαν εξασφαλιστεί οι κατάλληλες συνθήκες σε υγρέςκαλλιέργειες ερυθροβλαστών από φυσιολογικά CD34+ κύτταρα ΜΟ ή ΟΠΑ.Πραγματοποιήθηκε συλλογή 15-20 ξεχωριστών κλώνων BFUe από κάθε ασθενή καιέγινε έλεγχος της ικανότητας μεταγωγής του φορέα με ημι-ποσοτική αλυσιδωτήαντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου. Επίσης, υπολογίστηκε ο αριθμός τωνVCN/κύτταρο για κάθε θετικό κλώνο από κάθε ασθενή και στη συνέχειαυπολογίστηκε ένας μέσος όρος από όλα τα θετικά BFUe από κάθε ασθενή. Σεεπίπεδο υγρών καλλιεργειών ερυθροβλαστών, υπολογίστηκε το ποσοστόδιαφοροποίησης των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής για τον ερυθροειδικό δείκτηΓλυκοφορίνη Α, το ποσοστό πολλαπλασιασμού των κυττάρων και ο αριθμός τωνορθοχρωματικών ερυθροβλαστών σε παρασκευάσματα κυτταροφυγοκέντρου.Επίσης, η έκφραση της HbF μετρήθηκε τόσο με κυτταρομετρία ροής, όπουυπολογίσθηκε το ποσοστό των διαφοροποιημένων κυττάρων που εκφράζουν HbFκαι η μέση ένταση φθορισμού-MFI, όσο με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης(HPLC) και σε επίπεδο μετάγραφου με RT-PCR. Τέλος, αξιολογήθηκε μεκυτταρομετρία ροής για το μονοκλωνικό αντίσωμα Ανεξίνη V, η ικανότητα του GGHIφορέα να μειώνει το ποσοστό της απόπτωσης στους μεταγμένους με το φορέα GGHIερυθροβλάστες από τις υγρές καλλιέργειες σε σχέση με τα ψευδώς μεταγμένακύτταρα.Αποτελέσματα Στόχου 2: Ο τυπικός αριθμός κυττάρων που απομονώθηκαναπό τον ΜΟ κυμαινόταν από 1-2 ×106 CD34+ κύτταρα, ενώ από 20 ml περιφερικούάιματος κυμαινόταν από 104 έως 4 ×105 CD34+ κύτταρα. Σε επίπεδο κλώνων BFUe,o GGHI φορέας ενεφάνησε μέση ικανότητα μεταγωγής 40.3% μέ μέσο όρο 1.1VCN/κύτταρο για κάθε ασθενή. Οι συνθήκες διαφοροποίησης των CD34+ κυττάρωνστις υγρές καλλιέργειες φάνηκε να μην επηρεάζουν τo ποσοστό της HbF, το οποίοεξαρτάται σημαντικά από την πηγή προέλευσης των κυττάρων και είναι τρεις φορέςμικρότερο in vitro (26.7±19,9%) σε σχέση με το μέσο ποσοστό in vivo(67.52±41,56%), όπως υπολογίστηκε με HPLC στους θαλασσαιμικούς ασθενείς.Συνεπώς, η αύξηση της HbF και η συνακόλουθη φαινοτυπική διόρθωση πουπαρατηρείται στις υγρές καλλιέργειες οφείλεται αποκλειστικά στον φορέα GGHI.Έτσι, στα μεταγμένα κύτταρα παρατηρείται υψηλότερο ποσοστό διαφοροποιημένωνκυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρα που είναι ψευδώς μεταγμένα με κενά ιικάσωμάρια (GGHI κύτταρα: 25.2%, Μάρτυρας: 14.5%, p=0.00077), καθώς καιαυξημένη ικανότητα πολλαπλασιασμού τη 17η ημέρα (GGHI κύτταρα: 200%,Μάρτυρας: 32%). Επίσης, τα διορθωμένα κύτταρα παρουσίασαν αύξηση τηςέκφρασης της HbF, όπως υπολογίστηκε με κυτταρομετρία ροής σε σχέση με ταΠερίληψηxxxψευδώς μεταγμένα κύτταρα τόσο στο ποσοστό των κυττάρων F (%HbF: GGHIκύτταρα: 51.6%, Μάρτυρας: 47.3%, p=0.09), αλλά και της μέσης MFI (GGHI κύτταρα:449, Μάρτυρας: 409.4, p=0.005), όπως υπολογίστηκε συνολικά από όλους τουςασθενείς. Πιο συγκεκριμένα, όπως υπολογίστηκε με HPLC τα μεταγμένα κύτταραπαράγουν μεγαλύτερη ποσότητα γ-αλυσίδων σφαιρίνης σε σχέση με τα ψευδώςμεταγμένα, με 32.9% (p=0.001) μέση αύξηση από όλους τους ασθενείς. Τέλος, αυτήη αύξηση της HbF σε πρωτεϊνικό επίπεδο επιβεβαιώθηκε και σε επίπεδο μετάγραφουόπου παρατηρήθηκε αύξηση περίπου 29.1 φορές στα μεταγμένα κύτταρα. Επιπλέον,η μεταγωγή με το GGHI φορέα επιφέρει σημαντική μείωση του ποσοστού τηςαπόπτωσης κατά 50%, όπως υπολογίστηκε με κυτταρομετρία ροής, όπου η μέσηMFI στα κύτταρα μάρτυρα ήταν 106.6 έναντι αυτής των μεταγμένων κυττάρων πουήταν 50.2 (p=0.007). Επίσης, η ίδια τάση παρατηρήθηκε στο ποσοστό τωναποπτωτικών κυττάρων, όπου παρατηρήθηκε 27.2% (p=0.007) μείωση. Τααποτελέσματα αυτά αξιολογήθηκαν περαιτέρω ξεχωριστά σε ασθενείς τόσο με βoόσο και με β+ θαλασσαιμία. Συμπερασματικά, ο αυτο-αδρανοποιούμενοςκαινοτομικός λεντιικός φορέας GGHI, είναι ικανός να επάγει υψηλά επίπεδαέκφρασης της HbF, με μεγάλη ικανότητα μεταγωγής και χαμηλά VCN/κύτταρο,βελτιώνοντας σημαντικά το θαλασσαιμικό φαινότυπο, όπως αξιολογήθηκε σε CD34+κύτταρα από θαλασσαιμικούς ασθενείς.• Ειδικός στόχος 3: In vivo αξιολόγηση της θεραπευτικής ικανότητας του LVGGHI μετά από μεταγωγή και μεταμόσχευση κυττάρων μυελού των οστών(ΜΜΟ) σε μοντέλο ποντικού β-θαλασσαιμίας.Αρχικά, απομονώθηκαν κύτταρα ΜΟ από μοντέλο ποντικού β-θαλασσαιμίαςCy57BL6/Hbbth3 (th3/+) και αφού καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο μέσο με κυτοκίνες,πραγματοποιήθηκε μεταγωγή των κυττάρων με τον φορέα GGHI σε διαδοχικέςπολλαπλότητες μόλυνσης ΜΟΙ=20, 50 και 100. Τα μεταγμένα κύτταρα του μυελούκαλλιεργήθηκαν σε ημι-σταθερό μέσο μεθυλοκυτταρίνης που ευνοεί την ανάπτυξημονάδων «εκρηκτικής αύξησης» ερυθροειδών κυττάρων, BFUe για προσδιορισμότης ικανότητας μεταγωγής του GGHI καθώς και των VCN/κύτταρo με ημι-ποσοτικήαντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου για κάθε πολλαπλότητα μόλυνσης.Στη συνέχεια, έγινε αξιολόγηση εναλλακτικού φαρμακευτικού πρωτοκόλου με τηχρήση μυελοκατασταλτικού (Bu, βουσουλφάνη) και ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων(Cy, κυκλοφωσφαμίδη, CsA, κυκλοσπορίνη) με σκοπό την επιτυχημένη ΜΜΟ και τηφαινοτυπική διόρθωση της β-θαλασσαιμίας στα th3/+ ποντίκια. Στα μεταμοσχευμέναποντίκια th3/+ με τα διορθωμένα θαλασσαιμικά κύτταρα του μυελού, έγινε έλεγχοςτης έκφρασης της HbF στο περιφερικό αίμα (ΠΑ) των μεταμοσχευμένων ποντικών μεΠερίληψηxxxiκυτταρομετρία ροής καθώς και αξιολόγηση της φαινοτυπικής διόρθωσης τωναιματολογικών παραμέτρων (αιματοκρίτης-HCT, αριθμός ερυθροκυττάρων-RBC,Αιμοσφαιρίνη-HBG) καθώς και της μορφολογίας των ερυθροκυττάρων μετά απόεπίστρωση και χρώση σε αντικειμενοφόρους πλάκες.Αποτελέσματα Στόχου 3: Παρατηρήθηκε ότι ο GGHI μπορεί να μετάγειεπιτυχώς τα κύτταρα από ΜΟ θαλασσαιμικού ποντικού th3/+ για ΜΟΙ=50 μεικανότητα μεταγωγής 100% και με μέσο VCN/κύτταρο=1.3. Εφαρμόστηκεφαρκακευτικό πρωτόκολο για ΜΜΟ το οποίο περιλαμβάνει συνδυασμόβουσουλφάνης (Bu-συνολική δόση 80 mg/kg ποντικού) με κυκλοφωσφαμίδη (Cy-200 mg/kg ποντικού) πριν τη ΜΜΟ και κυκλοσπορίνη (CsA-250μg/kg/δόση) γιαπροφύλαξη μετά τη ΜΜΟ, καθώς ο συνδυασμός αυτός αποδείχτηκε ότι επιφέρει τηνκαλύτερη ανοσοκαταστολή με τη

The New Self-Inactivating Lentiviral Vector for Thalassemia Gene Therapy Combining Two HPFH Activating Elements Corrects Human Thalassemic Hematopoietic Stem Cells

To address how low titer, variable expression, and gene silencing affect gene therapy vectors for hemoglobinopathies, in a previous study we successfully used the HPFH (hereditary persistence of fetal hemoglobin)-2 enhancer in a series of oncoretroviral vectors. On the basis of these data, we generated a novel insulated self-inactivating (SIN) lentiviral vector, termed GGHI, carrying the (A)gamma-globin gene with the -117 HPFH point mutation and the HPFH-2 enhancer and exhibiting a pancellular pattern of (A)gamma-globin gene expression in MEL-585 clones. To assess the eventual clinical feasibility of this vector, GGHI was tested on CD34(+) hematopoietic stem cells from nonmobilized peripheral blood or bone marrow from 20 patients with beta-thalassemia. Our results show that GGHI increased the production of gamma-globin by 32.9% as measured by high-performance liquid chromatography ( p=0.001), with a mean vector copy number per cell of 1.1 and a mean transduction efficiency of 40.3%. Transduced populations also exhibited a lower rate of apoptosis and resulted in improvement of erythropoiesis with a higher percentage of orthochromatic erythroblasts. This is the first report of a locus control region (LCR)-free SIN insulated lentiviral vector that can be used to efficiently produce the anticipated therapeutic levels of gamma-globin protein in the erythroid progeny of primary human thalassemic hematopoietic stem cells in vitro

The Optimized γ-Globin Lentiviral Vector GGHI-mB-3D Leads to Nearly Therapeutic HbF Levels In Vitro in CD34+ Cells from Sickle Cell Disease Patients

We have previously demonstrated that both the original γ-globin lentiviral vector (LV) GGHI and the optimized GGHI-mB-3D LV, carrying the novel regulatory elements of the 3D HPFH-1 enhancer and the 3’ β-globin UTR, can significantly increase HbF production in thalassemic CD34+ cells and ameliorate the disease phenotype in vitro. In the present study, we investigated whether the GGHI-mB-3D vector can also exhibit an equally therapeutic effect, following the transduction of sickle cell disease (SCD) CD34+ cells at MOI 100, leading to HbF increase coupled with HbS decrease, and thus, to phenotype improvement in vitro. We show that GGHI-mB-3D LV can lead to high and potentially therapeutic HbF levels, reaching a mean 2-fold increase to a mean value of VCN/cell of 1.0 and a mean transduction efficiency of 55%. Furthermore, this increase was accompanied by a significant 1.6-fold HbS decrease, a beneficial therapeutic feature for SCD. In summary, our data demonstrate the efficacy of the optimized γ-globin lentiviral vector to improve the SCD phenotype in vitro, and highlights its potential use in future clinical SCD trials

Characterization and comparative performance of lentiviral vector preparations concentrated by either one-step ultrafiltration or ultracentrifugation

Gene therapy utilizing lentiviral vectors (LVs) constitutes a real therapeutic alternative for many inherited monogenic diseases. Therefore, the generation of functional vectors using fast, non-laborious and cost-effective strategies is imperative. Among the available concentration methods for VSV-G pseudo-typed lentiviruses to achieve high therapeutic titers, ultracentrifugation represents the most common approach. However, the procedure requires special handling and access to special instrumentation, it is time-consuming, and most importantly, it is cost-ineffective due to the high maintenance expenses and consumables of the ultracentrifuge apparatus. Here we describe an improved protocol in which vector stocks are prepared by transient transfection using standard cell culture media and are then concentrated by ultrafiltration, resulting in functional vector titers of up to 6 x 10(9) transducing units per millilitre (TU/ml) without the involvement of any purification step. Although ultrafiltration per se for concentrating viruses is not a new procedure, our work displays one major novelty; we characterized the nature and the constituents of the viral batches produced by ultrafiltration using peptide mass fingerprint analysis. We also determined the viral functional titer by employing flow cytometry and evaluated the actual viral particle size and concentration in real time by using laser-based nanoparticle tracking analysis based on Brownian motion. Vectors generated by this production method are contained in intact virions and when tested to transduce in vitro either murine total bone marrow or human CD34(+) hematopoietic stem cells, resulted in equal transduction efficiency and reduced toxicity, compared to lentiviral vectors produced using standard ultracentrifugation-based methods. The data from this study can eventually lead to the improvement of protocols and technical modifications for the clinical trials for gene therapy. (C) 2013 Elsevier B.V. All rights reserved

Therapeutic levels of fetal hemoglobin in erythroid progeny of beta-thalassemic CD34(+) cells after lentiviral vector-mediated gene transfer

beta-Thalassemia major results from severely reduced or absent expression of the beta-chain of adult hemoglobin (alpha(2)beta(2); HbA). Increased levels of fetal hemoglobin (alpha(2)gamma(2); HbF), such as occurs with hereditary persistence of HbF, ameliorate the severity of beta-thalassemia, raising the potential for genetic therapy directed at enhancing HbF. We used an in vitro model of human erythropoiesis to assay for enhanced production of HbF after gene delivery into CD34(+) cells obtained from mobilized peripheral blood of normal adults or steady-state bone marrow from patients with beta-thalassemia major. Lentiviral vectors encoding (1) a human gamma-globin gene with or without an insulator, (2) a synthetic zinc-finger transcription factor designed to interact with the gamma-globin gene promoters, or (3) a short-hairpin RNA targeting the gamma-globin gene repressor, BCL11A, were tested. Erythroid progeny of normal CD34(+) cells demonstrated levels of HbF up to 21% per vector copy. For beta-thalassemic CD34(+) cells, similar gene transfer efficiencies achieved HbF production ranging from 45% to 60%, resulting in up to a 3-fold increase in the total cellular Hb content. These observations suggest that both lentiviral-mediated gamma-globin gene addition and genetic reactivation of endogenous gamma-globin genes have potential to provide therapeutic HbF levels to patients with gamma-globin deficiency. (Blood. 2011; 117(10): 2817-2826

Dissecting the Contributions of Cooperating Gene Mutations to Cancer Phenotypes and Drug Responses with Patient-Derived iPSCs

Summary: Connecting specific cancer genotypes with phenotypes and drug responses constitutes the central premise of precision oncology but is hindered by the genetic complexity and heterogeneity of primary cancer cells. Here, we use patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and CRISPR/Cas9 genome editing to dissect the individual contributions of two recurrent genetic lesions, the splicing factor SRSF2 P95L mutation and the chromosome 7q deletion, to the development of myeloid malignancy. Using a comprehensive panel of isogenic iPSCs—with none, one, or both genetic lesions—we characterize their relative phenotypic contributions and identify drug sensitivities specific to each one through a candidate drug approach and an unbiased large-scale small-molecule screen. To facilitate drug testing and discovery, we also derive SRSF2-mutant and isogenic normal expandable hematopoietic progenitor cells. We thus describe here an approach to dissect the individual effects of two cooperating mutations to clinically relevant features of malignant diseases. : Papapetrou and colleagues develop a comprehensive panel of isogenic iPSC lines with SRSF2 P95L mutation and chr7q deletion. They use these cells to identify cellular phenotypes contributed by each genetic lesion and therapeutic vulnerabilities specific to each one and develop expandable hematopoietic progenitor cell lines to facilitate drug discovery. Keywords: induced pluripotent stem cells, myelodysplastic syndrome, CRISPR/Cas9, gene editing, mutational cooperation, splicing factor mutations, spliceosomal mutations, SRSF2, chr7q deletio

Acute Myeloid Leukemia iPSCs Reveal a Role for RUNX1 in the Maintenance of Human Leukemia Stem Cells

Leukemia stem cells (LSCs) are believed to have more distinct vulnerabilities than the bulk acute myeloid leukemia (AML) cells, but their rarity and the lack of universal markers for their prospective isolation hamper their study. We report that genetically clonal induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from an AML patient and characterized by exceptionally high engraftment potential give rise, upon hematopoietic differentiation, to a phenotypic hierarchy. Through fate-tracking experiments, xenotransplantation, and single-cell transcriptomics, we identify a cell fraction (iLSC) that can be isolated prospectively by means of adherent in vitro growth that resides on the apex of this hierarchy and fulfills the hallmark features of LSCs. Through integrative genomic studies of the iLSC transcriptome and chromatin landscape, we derive an LSC gene signature that predicts patient survival and uncovers a dependency of LSCs, across AML genotypes, on the RUNX1 transcription factor. These findings can empower efforts to therapeutically target AML LSCs. [Display omitted] •AML-iPSC-derived hematopoietic cells recapitulate a LSC hierarchy•iLSCs can be easily prospectively isolated•A LSC 16-gene set correlates with AML patient survival•The RUNX1 TF is critical for the maintenance of LSCs across AML genetic subgroups Wesely et al. report that AML-iPSC-derived hematopoietic cells are hierarchically organized and contain cells with hallmark features of LSCs (iLSCs). Through integrative genomic studies of bulk and single-cell transcriptomes and chromatin accessibility, they derive a LSC gene signature and identify RUNX1 as an AML LSC dependency with therapeutic implications

Therapeutic levels of fetal hemoglobin in erythroid progeny of β-thalassemic CD34+ cells after lentiviral vector-mediated gene transfer

β-Thalassemia major results from severely reduced or absent expression of the β-chain of adult hemoglobin (α2β2;HbA). Increased levels of fetal hemoglobin (α2γ2;HbF), such as occurs with hereditary persistence of HbF, ameliorate the severity of β-thalassemia, raising the potential for genetic therapy directed at enhancing HbF. We used an in vitro model of human erythropoiesis to assay for enhanced production of HbF after gene delivery into CD34+ cells obtained from mobilized peripheral blood of normal adults or steady-state bone marrow from patients with β-thalassemia major. Lentiviral vectors encoding (1) a human γ-globin gene with or without an insulator, (2) a synthetic zinc-finger transcription factor designed to interact with the γ-globin gene promoters, or (3) a short-hairpin RNA targeting the γ-globin gene repressor, BCL11A, were tested. Erythroid progeny of normal CD34+ cells demonstrated levels of HbF up to 21% per vector copy. For β-thalassemic CD34+ cells, similar gene transfer efficiencies achieved HbF production ranging from 45% to 60%, resulting in up to a 3-fold increase in the total cellular Hb content. These observations suggest that both lentiviral-mediated γ-globin gene addition and genetic reactivation of endogenous γ-globin genes have potential to provide therapeutic HbF levels to patients with β-globin deficiency