MarVis-Filter: Ranking, Filtering, Adduct and Isotope Correction of Mass Spectrometry Data

Statistical ranking, filtering, adduct detection, isotope correction, and molecular formula calculation are essential tasks in processing mass spectrometry data in metabolomics studies. In order to obtain high-quality data sets, a framework which incorporates all these methods is required. We present the MarVis-Filter software, which provides well-established and specialized methods for processing mass spectrometry data. For the task of ranking and filtering multivariate intensity profiles, MarVis-Filter provides the ANOVA and Kruskal-Wallis tests with adjustment for multiple hypothesis testing. Adduct and isotope correction are based on a novel algorithm which takes the similarity of intensity profiles into account and allows user-defined ionization rules. The molecular formula calculation utilizes the results of the adduct and isotope correction. For a comprehensive analysis, MarVis-Filter provides an interactive interface to combine data sets deriving from positive and negative ionization mode. The software is exemplarily applied in a metabolic case study, where octadecanoids could be identified as markers for wounding in plants

Stoffbeschreibung Boscalid - Kontaminationsrisiko in der Bio-Wertschöpfungskette

Boscalid wird in der konventionellen Landwirtschaft als systemisches Fungizid in zahlreichen Kulturen (Obst, Gemüse, Weinbau, Ackerbau) eingesetzt. Eine Studie des FiBL zeigt, dass aufgrund der schlechten Abbaubarkeit des Wirkstoffes Kontaminationen über den Boden möglich sind

Signale und metabolische Konsequenzen während der Interaktion von Brassicaceen und <i>Verticillium longisporum</i>

Das bodenbürtige, hemibiotrophe Pathogen Verticillium longisporum ist eine ernsthafte Bedrohung des Rapsanbaus (Brassica napus). Um effektive Abwehrmaßnahmen zu entwickeln, ist es notwendig die Pflanze-Pathogen-Interaktion gut zu verstehen. Diese Arbeit zielte daher darauf ab, metabolische Veränderungen und beteiligte Stoffwechselwege im pathogenen Pilz sowie in der befallenen Wirtspflanze aufzufinden und zu identifizieren. Dafür wurde ein „Metabolite Fingerprinting“-Versuchsansatz durch Anpassung der analytischen Parameter und der Extraktionsmethoden für die untersuchte Probenart optimiert. Um durch V. longisporum produzierte extrazelluläre Metabolite in Xylemgefäßen zu identifizieren, wurde ein in vitro Versuch etabliert. Dies führte zur Identifizierung von sieben Metaboliten aus dem Tryptophanmetabolismus, die in einer xylemartigen Umgebung akkumulieren. Keine der pilzlichen, in vitro produzierten Substanzen konnte jedoch in planta nach V. longisporum Infektion nachgewiesen werden. Daher wurden alle Substanzen, die sich in der Pflanze anreicherten, analysiert. Eine vergleichende Analyse der apoplastischen Flüssigkeiten und verschiedener Pflanzenorgane in einer Zeitspanne von 5 bis 35 Tage nach Infektion in B. napus zeigte eine starke Veränderung des Metabolitenmusters durch die Pilzinfektion. Die Identifizierung von ubiquitär akkumulierenden Infektionsmarkern führte zur Auffindung des Phytoalexins Cyclobrassinin und 22 verwandten, erstmals beschriebenen Substanzen. Die Aufklärung der Strukturen erfolgte über MS/MS und pseudo-MS/MS/MS Fragmentierung. Die Verteilung der Cyclobrassinin-verwandten Stoffe innerhalb der Pflanze korrelierte mit der pilzlichen DNA-Menge in den Pflanzenorganen. Dies deutet auf eine hohe Kontamination und eine starke Antwort auf Metabolitenebene im Hypocotylgewebe hin. Durch Kombination der erhobenen Strukturdaten mit einem vorgeschlagenen Stoffwechselweg für das Phytoalexin Camalexin in Arabidopsis thaliana konnte ein analoges Modell für den Biosyntheseweg von Cyclobrassinin erstellt werden. Eine Teilgruppe der infizierten Infektionsmarker deutet auf den Abbau von Cyclobrassinin zu 2-Mercapto-indol-3-carboxylsäure (MICA) Derivaten hin. Unter Einbeziehung von Proben von Camelina sativa – dessen Infektion mit V. longisporum in dieser Arbeit das erste Mal beschrieben wurde – und A. thaliana in die vergleichende Analyse von Brassicaceen, stellte sich heraus, dass andere Infektionsmarkergruppen verbreiteter auftreten als die artspezifischen, Cyclobrassinin-verwandten Substanzen. Raphanusamsäure (RA), eine vermutlich mit dem Phytoalexin- oder Glucosinolat-Stoffwechsel verwandte Substanz, Pipecolinsäure und drei glycosylierte Derivate der Salicylsäure (SA) akkumulierten in den drei Brassicaceen. Zwei Trihydroxyfettsäuren wurden als Infektionsmarker in den apoplastischen Flüssigkeiten von B. napus und A. thaliana identifiziert. Weiterhin wurden fünf Infektionsmarkergruppen ausschließlich in der Apoplastischen Waschflüssigkeit (AWF) identifiziert. Gesättigte Dicarbonsäuren und ihre Monoamid-Derivate sind Infektionsmarker in B. napus und A. thaliana. Zudem wurden in B. napus Anreicherungen der Diamid-, Aldehyd- und Alkohol-Derivate gefunden. Die Mono- und Diamide wurden eindeutig durch chemisch synthetisierte Standards bestätigt. In einer gerichteten Analyse wurden zudem drei Polyamine als Infektionsmarker festgestellt. Glucosinolate hingegen, die oft in Pflanze-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind, waren in B. napus keine verlässlichen Infektionsmarker. Vorläufige Ergebnisse eines Raps-Priming-Experiments mit Azelainsäure (C9-Dicarbonsäure) deuten nur eine Verschiebung in der Cyclobrassinin-Biosynthese an, aber keine gesteigerte Resistenz gegenüber V. longisporum. Ein infektionsähnliches Metabolitenmuster konnte nicht durch Flotation auf verschiedenen Infektionsmarkern wie SA oder RA erzeugt werden. Die Behandlung von B. napus Blättern mit CuCl2 zeigte, dass es sich bei den Cyclobrassinin-verwandten Substanzen um pflanzliche Stoffe handelt. Sie akkumulieren in Raps ebenso wie RA, SAG und Pipecolinsäure nach biotischem wie auch abiotischem Stress. In der Summe wurden mehr als 70 Metabolite eindeutig identifiziert. Dabei handelt es sich entweder um pilzliche Substanzen, die in in vitro Versuchen akkumulieren oder um pflanzliche Substanzen in Brassicaceen nach Infektion mit V. longisporum

Fungal DNA, stunting of the rosette, and relative transcript abundance of genes encoding apoplastic proteins from <i>Arabidopsis thaliana</i> that were either induced or repressed by treatment with <i>Verticillium longisporum</i> (VL43).

<p>(A) Typical time course of stunting white symbols) and VL43 DNA (black symbols) in Arabidopsis rosettes (n≥4 biological replicates ± SE, except 10 dpi, where pooled samples were analyzed due limited material), T = traces of VL43 DNA detected. Stunting was determined as projected rosette area of VL infected plants/projected rosette area of mock inoculated plants. (B) Transcript levels of <i>CILLP</i>, <i>SCPL20</i>, <i>AGAL2</i> and <i>GLP3</i> and (C) transcript levels of the peroxidases <i>PRX52</i> (right axis), <i>PRX34</i>, <i>P37</i> and <i>PA2</i> (left axis). Transcript levels were normalized to actin and expressed as transcript abundance in VL-infected plants/transcript abundance in mock-inoculated plants (n≥6 biological replicates ± SE). *indicate significant differences between mock and VL-infected plants.</p

Metabolic fingerprinting of AWFs of mock- and <i>Verticillium longisporum</i> VL43-infected <i>Arabidopsis thaliana</i> plants.

<p>AWF was obtained from <i>A. thaliana</i> leaves 21 days post infection and analyzed by UPLC-TOF-MS. (A) PCA plot of compounds in extracted AWFs measured in negative ionization mode. Samples from mock treated plants are framed in black whereas samples from infected plants are framed in red. (B) 1D-SOM matrix after metabolite-based clustering of the 1775 infection markers with <i>p</i><5×10⁻⁴. Data sets from positive and negative ionisation mode were combined. Red framed prototypes indicate markers with increased intensities after VL infection. The data set includes three biological replicates with three technical replicates per sample. The vertical axis represents the two experimental conditions. The horizontal axis corresponds to the cluster numbers. The intensities were normalized and colour coded according to the indicated scale.</p

Influence of <i>Verticillium longisporum</i> VL43 infection on protein content of whole leaf extracts, in apoplastic washing fluid and on the number of protein spots after 2-D electrophoresis.

<p>Plants were analyzed 25 days post infection. Protein spots were determined by Proteomweaver software in silver stained gels (cf. <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0031435#pone-0031435-g001" target="_blank">Fig. 1</a>). Data indicate means (N ± SE).</p

Proteins identified by LC-MS/MS in the apoplast of <i>Arabidopsis thaliana</i> leaves.

<p>*encoded in the chloroplast genome.</p><p>Apoplastic washing fluids from mock-infected plants were separated by 2-D-gel electrophoresis, picked, trypsinated and used for determination fragment composition by LC-MS/MS. Identification was achieved by data bank queries as outlined under <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0031435#s4" target="_blank">materials and methods</a>. Spot numbers refer to those shown in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0031435#pone-0031435-g001" target="_blank">Fig. 1</a>. S, C, and M indicate predicted signal peptides for the secretory pathway, chloroplasts or mitochondria, respectively. RC indicates reliability classes for the prediction of localization (1 = high, 5 = low). Peptides are shown in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0031435#pone.0031435.s003" target="_blank">Table S1</a>.</p

Proteins significantly affected in the apoplast of <i>Verticillilum longisporum</i> VL43-infected compared with that of mock-infected <i>Arabidopsis thaliana</i> leaves.

<p>*Factor: protein abundance in samples of VL-treated plants/protein abundance in mock-inoculated plants,</p><p>**92% homology to PRX At437520.</p><p>Only those spots were analyzed that were reproducibly observed in two independent experiments. In each experiment three biological replicates were analyzed. For further details, see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0031435#pone-0031435-t004" target="_blank">Table 4</a>. Spot identification numbers refer to those shown in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0031435#pone-0031435-g001" target="_blank">Figure 1</a>. Peptides are shown in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0031435#pone.0031435.s003" target="_blank">Table S1</a>.</p