Tracking the connection between evolutionary and functional shifts using the fungal lipase/feruloyl esterase A family

BACKGROUND: There have been many claims of adaptive molecular evolution, but what role does positive selection play in functional divergence? The aim of this study was to test the relationship between evolutionary and functional shifts with special emphasis on the role of the environment. For this purpose, we studied the fungal lipase/feruloyl esterase A family, whose functional diversification makes it a very promising candidate. RESULTS: The results suggested functional shift following a duplication event where neofunctionalisation of feruloyl esterase A had occurred with conservation of the ancestral lipase function. Evolutionary shift was detected using the branch-site model for testing positive selection on individual codons along specific lineages. Positively selected amino acids were detected. Furthermore, biological data obtained from site-directed mutagenesis experiments clearly demonstrated that certain amino acids under positive selection were involved in the functional shift. We reassessed evolutionary history in terms of environmental response, and hypothesized that environmental changes such as colonisation by terrestrial plants might have driven adaptation by functional diversification in Euascomycetes (Aspergilli), thus conferring a selective advantage on this group. CONCLUSION: The results reported here illustrate a rare example of connection between fundamental events in molecular evolution. We demonstrated an unequivocal connection between evolutionary and functional shifts, which led us to conclude that these events were probably linked to environmental change

Automated assay for screening the enzymatic release of reducing sugars from micronized biomass

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>To reduce the production cost of bioethanol obtained from fermentation of the sugars provided by degradation of lignocellulosic biomass (<it>i.e</it>., second generation bioethanol), it is necessary to screen for new enzymes endowed with more efficient biomass degrading properties. This demands the set-up of high-throughput screening methods. Several methods have been devised all using microplates in the industrial SBS format. Although this size reduction and standardization has greatly improved the screening process, the published methods comprise one or more manual steps that seriously decrease throughput. Therefore, we worked to devise a screening method devoid of any manual steps.</p> <p>Results</p> <p>We describe a fully automated assay for measuring the amount of reducing sugars released by biomass-degrading enzymes from wheat-straw and spruce. The method comprises two independent and automated steps. The first step is the making of "substrate plates". It consists of filling 96-well microplates with slurry suspensions of micronized substrate which are then stored frozen until use. The second step is an enzymatic activity assay. After thawing, the substrate plates are supplemented by the robot with cell-wall degrading enzymes where necessary, and the whole process from addition of enzymes to quantification of released sugars is autonomously performed by the robot. We describe how critical parameters (amount of substrate, amount of enzyme, incubation duration and temperature) were selected to fit with our specific use. The ability of this automated small-scale assay to discriminate among different enzymatic activities was validated using a set of commercial enzymes.</p> <p>Conclusions</p> <p>Using an automatic microplate sealer solved three main problems generally encountered during the set-up of methods for measuring the sugar-releasing activity of plant cell wall-degrading enzymes: throughput, automation, and evaporation losses. In its present set-up, the robot can autonomously process 120 triplicate wheat-straw samples per day. This throughput can be doubled if the incubation time is reduced from 24 h to 4 h (for initial rates measurements, for instance). This method can potentially be used with any insoluble substrate that is micronizable. A video illustrating the method can be seen at the following URL: <url>http://www.youtube.com/watch?v=NFg6TxjuMWU</url></p

Comparative secretome analyses of two Trichoderma reesei RUT-C30 and CL847 hypersecretory strains

ABSTRACT: BACKGROUND: Due to its capacity to produce large amounts of cellulases, Trichoderma reesei is increasingly been researched in various fields of white biotechnology, especially in biofuel production from lignocellulosic biomass. The commercial enzyme mixtures produced at industrial scales are not well characterized, and their proteinaceous components are poorly identified and quantified. The development of proteomic methods has made it possible to comprehensively overview the enzymes involved in lignocellulosic biomass degradation which are secreted under various environmental conditions. RESULTS: The protein composition of the secretome produced by industrial T. reesei (strain CL847) grown on a medium promoting the production of both cellulases and hemicellulases was explored using two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF or LC-MS/MS protein identification. A total of 22 protein species were identified. As expected, most of them are potentially involved in biomass degradation. The 2D map obtained was then used to compare the secretomes produced by CL847 and another efficient cellulolytic T. reesei strain, Rut-C30, the reference cellulase-overproducing strain using lactose as carbon source and inducer of cellulases. CONCLUSION: This study provides the most complete mapping of the proteins secreted by T. reesei to date. We report on the first use of proteomics to compare secretome composition between two cellulase-overproducing strains Rut-C30 and CL847 grown under similar conditions. Comparison of protein patterns in both strains highlighted many unexpected differences between cellulase cocktails. The results demonstrate that 2D electrophoresis is a promising tool for studying cellulase production profiles, whether for industrial characterization of an entire secretome or for a more fundamental study on cellulase expression at genome-wide scale

Expression et caractérisation fonctionnelle des cinnamoyl esterases d'aspergillus niger pour les biotechnologies blanches

Certains co-produits, résultants de l'utilisation de la biomasse végétale comme matière première, représentent une source de composés valorisables dans de nombreux domaines (pâtes et papiers, bioéthanol, arômes, antioxydants). Les champignons filamenteux fournissent des outils enzymatiques de valorisation particulièrement performants pour la dégradation de la biomasse végétale. Nous nous sommes intéressés à trois cinnamoyl estérases produites par Aspergillus niger : la féruloyl estérase B (FaeB), la féruloyl estérase A (FaeA) et la chlorogénate hydrolase (ChloE). Dans une première partie, la FaeB et la ChloE ont été surproduites chez A. Niger. Les niveaux de production en fioles de la FaeB et de la ChloE représentent respectivement 100mg.L-1 et 1,25 g.L-1 . Les protéines recombinantes ont été purifiées et caractérisées. Le gène de la chlorogénate estérase est le premier décrit. Dans une deuxième partie, grâce à l'utilisation successive de différents plans d'expériences, nous avons produit chez Escherichia coli et cristallisé en quelques semaines la FaeA d'A. niger. La structure de cette protéine a été résolue. La comparaison de plusieurs formes glycosylées et non glycosylées de FaeA produites respectivement chez E. coli et A. niger nous a conduit à étudier l'impact de la glycosylation et du repliement artificiel sur l'activité et la thermostabilité de cette protéine. La troisième partie concerne la mise en oeuvre de ces enzymes sur des co-produits agro-industriels riches en acides hydroxycinnamiques. Cette étude confirme l'intérêt de ces enzymes comme outil d'aide à la destructuration des parois végétales et pour la libération de composés phénoliques d'intérêt.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

Des champignons filamenteux éliminent les polluants organiques des sols et des eaux

Des champignons filamenteux éliminent les polluants organiques des sols et des eaux. Salon SIAL 9

Modelage des génomes fongiques pour la transformation des parois végétales (conception et surproduction de nouveaux outils enzymatiques chimères)

Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont eu pour objectif de i) concevoir et surproduire chez les champignons filamenteux de nouveaux outils enzymatiques performants pour la dégradation de la biomasse végétale et ii) d étudier les relations synergiques existant au sein de ces enzymes hybrides bi- ou multi-modulaires. Dans une première partie, des enzymes libres impliquées dans la dégradation des hémicelluloses ont été surproduites chez Aspergillus niger (la féruloyl estérase B, FAEB et la xylanase B, XYNB). Les niveaux de production en fioles ont atteint respectivement, 100 mg.L-1 et 900 mg.L-1 pour la FAEB et XYNB. Ces protéines recombinantes ont été purifiées puis caractérisées. La seconde partie de l étude a porté sur la conception et la production d enzymes chimères dans lesquelles des modules d intérêt ont été rapprochés physiquement en utilisant des fusions traductionnelles. Dans cette étude, la production d une protéine chimère basée sur le modèle des enzymes cellulosomales bactériennes a été réalisée chez A. niger. Ces travaux ont permis de produire la première enzyme fongique, FAEA, fusionnée à un module bactérien dockérine fonctionnel. Le travail sur les protéines chimères a été élargi en fusionnant deux enzymes complémentaires, la FAEA et XYNB afin d améliorer l efficacité enzymatique globale en favorisant l action synergique entre les partenaires fusionnés. De plus, dans une seconde construction, un module de fixation à la cellulose (CBM) a été additionné à cette protéine bifonctionnelle pour étudier l effet du ciblage vers le substrat. Ces enzymes bifonctionnelles ont été surproduites (~1,5 g.L-1), caractérisées et testées dans le cadre du relargage d un composé à haute valeur ajoutée, l acide férulique à partir de sous-produits agricoles et se sont montrées plus efficaces que les enzymes libres correspondantes. Par conséquent, le rapprochement physique entre une enzyme principale (XYNB) et une enzyme secondaire (FAEA) ainsi que le ciblage apporté par le module non-catalytique (CBM) a permis de favoriser la synergie enzymatique et représente une stratégie intéressante pour l amélioration enzymatique. Une dernière étude basée sur une nouvelle enzyme hybride a été également réalisée, chez un nouvel hôte, dans le cadre de cette thèse. La construction de ces protéines chimères performantes présente de grands intérêts dans de nombreuses applications du domaine de la chimie verte, notamment pour la production de biocarburants à partir de la biomasse végétale.The objectives of this thesis were i) to design and overproduce new and efficient enzymatic tools in filamentous fungi involved in the plant-cell-wall degradation and ii) to study the synergistic relationships of the corresponding bi- or multi-modular hybrid enzymes. Firstly, free hemicellulolytic enzymes were overproduced in Aspergillus niger (feruloyl esterase B, FAEB and xylanase B, XYNB). Production yields reached 100 mg.L-1 et 900 mg.L-1 for FAEB and XYNB, respectively. Recombinant proteins were purified and fully characterized. Secondly, this study concerned the design and production of chimeric enzymes, in which modules of interest were fused together to enable physical proximity between them. In this study, a chimeric enzyme, based on the model of bacterial cellulosome, was produced in A. niger. The first fungal enzyme, FAEA, fused to a functional bacterial dockerin module, was successfully produced. Our work was extended to others hybrid proteins by fusing two complementary enzymes, FAEA and XYNB in order to improve the enzymatic efficiency, by increasing synergistic effect of the fused enzymes. Moreover, in a second construction, a Carbohydrate-Binding Module (CBM) was added to the bifunctional enzyme to study the effect of the substrate targeting. These bifunctional enzymes were overproduced (~1,5 g.L-1), characterized, and tested for the ferulic-acid release from agricultural by-products and their action was improved as compared to that of the corresponding free enzymes. Therefore, physical proximity between these primary (XYNB) and secondary (FAEA) enzymes and the substrate targeting by the CBM promote the enzymatic synergy. Finally, a new hybrid enzyme was designed in a new host in this work. The design of these improved chimeric enzymes is of great interest for future applications in industrial sectors, such as the biofuel production from vegetal biomass.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

Des champignons filamenteux éliminent les polluants aromatiques des sols et des eaux

Des champignons filamenteux éliminent les polluants aromatiques des sols et des eaux. Salon International de l'Agricultur

Compréhension des mécanismes enzymatiques de transformation de la ligine par les champignons filamenteux pour l'obtention des fibres papetières à haute valeur ajoutée

La délignification est un phénomène complexe nécessitant l'interaction de nombreuses enzymes aux capacités catalytiques complémentaires. Les champignons de la pourriture blanche sont les seuls micro-organismes capables de minéraliser la lignine. Pour cela ils sécrètent de nombreuses oxydoréductases lignolytiques comme les laccases et les lignines, manganèse, et versatiles peroxydases ainsi que des enzymes auxiliaires à la délignification comme les xylanases, les féruloyls estérases, les cellobiose déshydrogénases ou les aryl-alcools oxydases. Au cours de cette thèse, nous avons étudié les mécanismes de biotransformation de la lignine par les champignons filamenteux de la pourriture blanche. Pour cela, nous avons choisi comme modèle d'étude le basidiomycète "Pycnoporus cinnabarinus" en raison de sa forte aptitude à dégrader la lignine en ne sécrétant qu'une enzyme lignolytique, la laccase. Nous avons d'une part caractérisé les principales enzymes exocellulaires de "P. cinnabarinus" cultivé en présence de substrats naturels. D'autre part nous nous sommes intéressés plus spécifiquement à la caractérisation de la laccase de ce champignon produite sous forme native ou exprimée par deux hôtes recombinants, "Aspergillus niger" et "Aspergillus oryzae". Après avoir démontré la capacité d'"A. niger" à produire de manière hétérologue des enzymes fongiques fonctionnelles, nous avons utilisé cet hôte pour la production homologue de la féruloyl esterase-A et pour la production hétérologue du module de fixation à la cellulose du cellulosome de "Clostridium cellulolyticum" (CBM3a), ces deux protéines pouvant jouer un rôle important lors de la délignification. Enfin, nous avons testé la capacité de différentes enzymes de la lygnolyse à délignifier des pâtes à papier de plantes annuelles (pailles de blé et lin) et nous avons pu ainsi démontrer les coopérations existant entre les différentes enzymes lors de la dégradation ciblée de la lignine.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

Metabolic pathways of biotransformation and biosynthesis of aromatic compounds for the flavour industry by the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus

Among filamentous fungi, white-rot Basidiomycetes have become a strategic group to generate industrial aromatic flavours. In the course of a basidiomycete screening, the biotechnological potential of #Pycnoporus cinnabarinus strains was studied in order to produce, by transformation or de novo, natural aromatic flavours in liquid cultures. Ferulic acid and L-phenylalanine were found to be suitable substrates for vanillin and benzaldehyde (bitter almond aroma) production, respectively. These strains were also capable of producing de novo methylanthranilate, which has been described as the organoleptic note of wood strawberry. However, strains of #P. cinnabarinus often expressed laccase activity, which was unfavourable because the pathway to aromatic flavours is bypassed. To overcome this problem, the selection of monokaryotic laccase-deficient strains from basidiospores by classical genetics allowed to obtain more productive and more stable mycelial lines. (Résumé d'auteur