Differentiation of In Vitro–Modified Human Peripheral Blood Monocytes Into Hepatocyte–like and Pancreatic Islet-like Cells

BACKGROUND & AIMS: Adult stem cells provide a promising alternative for the treatment of diabetes mellitus and end-stage liver diseases. We evaluated the differentiation potential of human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells. METHODS: Monocytes were treated with macrophage colony-stimulating factor and interleukin 3 for 6 days, followed by incubation with hepatocyte and pancreatic islet-specific differentiation media. Cells were characterized by flow cytometry, gene-expression analysis, metabolic assays, and transplantation for their state of differentiation and tissue-specific functions. RESULTS: In response to macrophage colony-stimulating factor and interleukin 3, monocytes resumed cell division in a CD115-dependent fashion, which was associated with a down-regulation of the PRDM1 and ICSBP genes. These programmable cells of monocytic origin were capable of differentiating into neohepatocytes, which closely resemble primary human hepatocytes with respect to morphology, expression of hepatocyte markers, and specific metabolic functions. After transplantation into the liver of severe combined immunodeficiency disease/nonobese diabetic mice, neohepatocytes integrated well into the liver tissue and showed a morphology and albumin expression similar to that of primary human hepatocytes transplanted under identical conditions. Programmable cells of monocytic origin-derived pancreatic neoislets expressed beta cell-specific transcription factors, secreted insulin and C peptide in a glucose-dependent manner, and normalized blood glucose levels when xenotransplanted into immunocompetent, streptozotocin-treated diabetic mice. Programmable cells of monocytic origin retained monocytic characteristics, notably CD14 expression, a monocyte-specific methylation pattern of the CD115 gene, and expression of the transcription factor PU.1. CONCLUSIONS: The ability to reprogram, expand, and differentiate peripheral blood monocytes in large quantities opens the real possibility of the clinical application of programmable cells of monocytic origin in tissue repair and organ regeneration

Differenzierung adulter Stammzellen nach Transplantation in die Leber immundefizienter Mäuse

Der Bedarf an Spenderlebern für die Behandlung akuter und chronischer Lebererkrankungen kann zurzeit nicht gedeckt werden. Insbesondere für metabolische Lebererkrankungen hat sich die Transplantation von Hepatozyten als Alternative zur Lebertransplantation erwiesen. Diese Therapie wird wegen Mangel an Hepatozyten ausreichender Qualität nicht flächendeckend eingesetzt. Falls es möglich wäre, Stammzellen zu Hepatozyten zu differen-zieren, könnte dies für die Behandlung von Lebererkrankungen einen erheblichen Fortschritt bedeuten. Eine von vielen Arbeitsgruppen verfolgte Strategie zur Beurteilung des Differenzie-rungspotentials hepatischer Vorläuferzellen ist die Transplantation in die Leber immundefi-zienter Mäuse. Die in der vorliegenden Arbeit verfolgte Strategie bestand darin, zunächst 750.000 zu beurteilende Zellen entweder direkt in das Parenchym des linken Leberlappens oder in die Milz zu injizieren. Die anschließende Analytik verfolgte folgende Ziele: i) Identi-fikation der transplantierten Zellen. Dies wurde durch den kombinierten Einsatz von CM-DiI und Sonden gegen humane Alu-Sequenzen erreicht. Hierbei markierte CM-DiI lediglich grob die Areale, in die transplantiert wurde. Die in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden ermöglichte die konkrete Identifikation humaner Kerne. ii) Analyse der Expression hepatischer Faktoren, die von den ursprünglichen Stammzellen nicht gebildet wurden. Hierzu wurde ein für huma-nes Albumin spezifischer Antikörper eingesetzt. iii) Überprüfung, ob die human Albumin-positiven Zellen menschlichen Ursprungs sind. Hierzu wurde eine Kombination aus in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden und Immunhistochemie gegen humanes Albumin etabliert. Als Positivkontrolle dienten in der vorliegenden Arbeit primäre humane Hepatozyten. Das Ergebnis nach Transplantation humaner Hepatozyten wurde mit dem Ergebnis nach Trans-plantation adhärent proliferierender Nabelschnurblutzellen, hepatopankreatischen Vorläufer-zellen und aus peripheren humanen Blutmonozyten in vitro ausdifferenzierten Neohepatozy-ten verglichen. Anhand positiver Rotfluoreszenz wurden bereits im paraffinisierten Schnitt die Be-reiche der transplantierten CM-DiI-markierten Stammzellen identifiziert. Durch die in situ Hybridisierung mit Mensch-spezifischen Alu-Sonden wurden in den CM-DiI-positiven Area-len Menschkerne nachgewiesen. Immunhistochemisch wurde in diesen Bereichen eine Ex-pression humanen Albumins gezeigt. Vom umgebenden Gewebe waren die identifizierten Zellen durch einen kleinen dezentral gelegenen Zellkern, geringe Zellgröße und einer Hepato-zyten unähnlichen Morphologie zu unterschieden. Diese Zellen traten in der Regel als kleine-re Zellagglomerate auf, die entweder in Gefäßen oder ohne Endothelabgrenzung im Gewebe zu finden waren. Bei der Auswertung weiterer auf humanes Albumin untersuchter Gewebe-schnitte wurde ein zweiter morphologisch unterschiedlicher Typ humanes Albumin-exprimierender Zellen gefunden. Dieser war durch eine perfekte Hepatozytenmorphologie mit großem, zentral gelegenem Kern und polygonaler Form der Zelle charakterisiert. Im Gewebe lagen diese Zellen vereinzelt, ohne immunhistochemische Detektion wäre eine Unterschei-dung von Maushepatozyten nicht möglich gewesen. Mit der in situ Hybridisierung wurde für diese Zellen ein Mauskern nachgewiesen. Der seltener auftretende Zelltyp mit perfekter He-patozytenmorphologie wurde als Typ I und der kleinzellige Zelltyp als Typ II bezeichnet. Bemerkenswert hierbei ist, dass die beobachteten Typen human Albumin-positiver Zellen nach Transplantation aller drei miteinander verglichenen Zelltypen nachweisbar waren. Eine mögliche Erklärung des Befundes der Typ II-Zellen besteht in einer teilweisen Differenzie-rung in Richtung Hepatozyte. Die menschlichen Zellen exprimieren zwar Albumin, nicht aber andere Faktoren wie CYP3A4, und nehmen keine hepatozelluläre Morphologie an. Ein über-raschender Befund war die Typ I-Zelle. Der Mechanismus, der in diesen Zellen zur Expressi-on humanen Albumins führt, ist zurzeit ungeklärt. Mithilfe des EROD-Assays wurde die metabolische Aktivität der CYP1A-Isoenzyme bei in vitro differenzierten Neohepatozyten bestimmt. Hierbei wurde ein zeitabhängiger Um-satz von EROD zu Resorufin beobachtet, der aber nicht durch 3-Methylcholanthren induzier-bar war. Damit fehlt den Neohepatozyten in diesem Punkt eine wichtige Eigenschaft primärer Hepatozyten. Allerdings sind durch publizierte Untersuchungen an Neohepatozyten weitere Hepatozyten-spezifische Parameter wie Harnstoffzyklus und Albuminproduktion belegt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass nach Transplantation humaner Vor-läuferzellen verschiedenen Ursprungs ein qualitativ ähnliches Ergebnis mit zwei unterschied-lichen Typen human Albumin-positiver Zellen beobachtet wurde. Ob diese Zelltypen thera-peutisch nutzbar sind, bedarf weiterer Untersuchungen, beispielsweise mit Tiermodellen für menschliche Lebererkrankungen

Differenzierung adulter Stammzellen nach Transplantation in die Leber immundefizienter Mäuse

Der Bedarf an Spenderlebern für die Behandlung akuter und chronischer Lebererkrankungen kann zurzeit nicht gedeckt werden. Insbesondere für metabolische Lebererkrankungen hat sich die Transplantation von Hepatozyten als Alternative zur Lebertransplantation erwiesen. Diese Therapie wird wegen Mangel an Hepatozyten ausreichender Qualität nicht flächendeckend eingesetzt. Falls es möglich wäre, Stammzellen zu Hepatozyten zu differen-zieren, könnte dies für die Behandlung von Lebererkrankungen einen erheblichen Fortschritt bedeuten. Eine von vielen Arbeitsgruppen verfolgte Strategie zur Beurteilung des Differenzie-rungspotentials hepatischer Vorläuferzellen ist die Transplantation in die Leber immundefi-zienter Mäuse. Die in der vorliegenden Arbeit verfolgte Strategie bestand darin, zunächst 750.000 zu beurteilende Zellen entweder direkt in das Parenchym des linken Leberlappens oder in die Milz zu injizieren. Die anschließende Analytik verfolgte folgende Ziele: i) Identi-fikation der transplantierten Zellen. Dies wurde durch den kombinierten Einsatz von CM-DiI und Sonden gegen humane Alu-Sequenzen erreicht. Hierbei markierte CM-DiI lediglich grob die Areale, in die transplantiert wurde. Die in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden ermöglichte die konkrete Identifikation humaner Kerne. ii) Analyse der Expression hepatischer Faktoren, die von den ursprünglichen Stammzellen nicht gebildet wurden. Hierzu wurde ein für huma-nes Albumin spezifischer Antikörper eingesetzt. iii) Überprüfung, ob die human Albumin-positiven Zellen menschlichen Ursprungs sind. Hierzu wurde eine Kombination aus in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden und Immunhistochemie gegen humanes Albumin etabliert. Als Positivkontrolle dienten in der vorliegenden Arbeit primäre humane Hepatozyten. Das Ergebnis nach Transplantation humaner Hepatozyten wurde mit dem Ergebnis nach Trans-plantation adhärent proliferierender Nabelschnurblutzellen, hepatopankreatischen Vorläufer-zellen und aus peripheren humanen Blutmonozyten in vitro ausdifferenzierten Neohepatozy-ten verglichen. Anhand positiver Rotfluoreszenz wurden bereits im paraffinisierten Schnitt die Be-reiche der transplantierten CM-DiI-markierten Stammzellen identifiziert. Durch die in situ Hybridisierung mit Mensch-spezifischen Alu-Sonden wurden in den CM-DiI-positiven Area-len Menschkerne nachgewiesen. Immunhistochemisch wurde in diesen Bereichen eine Ex-pression humanen Albumins gezeigt. Vom umgebenden Gewebe waren die identifizierten Zellen durch einen kleinen dezentral gelegenen Zellkern, geringe Zellgröße und einer Hepato-zyten unähnlichen Morphologie zu unterschieden. Diese Zellen traten in der Regel als kleine-re Zellagglomerate auf, die entweder in Gefäßen oder ohne Endothelabgrenzung im Gewebe zu finden waren. Bei der Auswertung weiterer auf humanes Albumin untersuchter Gewebe-schnitte wurde ein zweiter morphologisch unterschiedlicher Typ humanes Albumin-exprimierender Zellen gefunden. Dieser war durch eine perfekte Hepatozytenmorphologie mit großem, zentral gelegenem Kern und polygonaler Form der Zelle charakterisiert. Im Gewebe lagen diese Zellen vereinzelt, ohne immunhistochemische Detektion wäre eine Unterschei-dung von Maushepatozyten nicht möglich gewesen. Mit der in situ Hybridisierung wurde für diese Zellen ein Mauskern nachgewiesen. Der seltener auftretende Zelltyp mit perfekter He-patozytenmorphologie wurde als Typ I und der kleinzellige Zelltyp als Typ II bezeichnet. Bemerkenswert hierbei ist, dass die beobachteten Typen human Albumin-positiver Zellen nach Transplantation aller drei miteinander verglichenen Zelltypen nachweisbar waren. Eine mögliche Erklärung des Befundes der Typ II-Zellen besteht in einer teilweisen Differenzie-rung in Richtung Hepatozyte. Die menschlichen Zellen exprimieren zwar Albumin, nicht aber andere Faktoren wie CYP3A4, und nehmen keine hepatozelluläre Morphologie an. Ein über-raschender Befund war die Typ I-Zelle. Der Mechanismus, der in diesen Zellen zur Expressi-on humanen Albumins führt, ist zurzeit ungeklärt. Mithilfe des EROD-Assays wurde die metabolische Aktivität der CYP1A-Isoenzyme bei in vitro differenzierten Neohepatozyten bestimmt. Hierbei wurde ein zeitabhängiger Um-satz von EROD zu Resorufin beobachtet, der aber nicht durch 3-Methylcholanthren induzier-bar war. Damit fehlt den Neohepatozyten in diesem Punkt eine wichtige Eigenschaft primärer Hepatozyten. Allerdings sind durch publizierte Untersuchungen an Neohepatozyten weitere Hepatozyten-spezifische Parameter wie Harnstoffzyklus und Albuminproduktion belegt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass nach Transplantation humaner Vor-läuferzellen verschiedenen Ursprungs ein qualitativ ähnliches Ergebnis mit zwei unterschied-lichen Typen human Albumin-positiver Zellen beobachtet wurde. Ob diese Zelltypen thera-peutisch nutzbar sind, bedarf weiterer Untersuchungen, beispielsweise mit Tiermodellen für menschliche Lebererkrankungen

Mathematical modelling of liver regeneration after intoxication with CCI4

Liver reaerteration is a complex process, having evolved to protect animals from the consequences of liver loss caused by food toxins. In this study, we established a mathematical spatial-temporal model of the liver lobule regenerating after CCI4 intoxication. The aim of modelling the regeneration process by matching experimental observations with those from a mathematical model is to gain a better understanding of the process and to recognize which parameters are relevant for specific phenomena. In order to set up a realistic minimal model, we first reconstructed a schematised liver lobule after determination of: (i) the mean number of hepatocytes between the central vein and the periphery of the lobule, (ii) the mean size of the hepatocytes and (iii) the mean number of hepatocyte columns in the inner, midzonal and peripheral ring of the lobule. In a next step, we determined the time course of cell death and BrdU incorporation after intoxication of male Sprague Dawley rats with CCI4, thereby differentiating between inner, midzonal and peripheral hepatocytes. These parameters were used to construct a model. The basic unit of this model is the individual cell. The detailed behaviour of the cells is studied, controlled by the model parameters: (1) probability of cell division at defined positions of the lobule at a given time, (2) '' coordinated cell orientation '', i.e., the ability of the cells to align during the regeneration process into columns towards the central vein of a liver lobule, (3) cell cycle duration, (4) the migration activity and (5) the polarity of the hepatocytes resulting in polar cell-cell adhesion between them. In a schematised lobule, the model shows that CCI4 initially induced cell death of a pericentral ring of hepatocytes, followed by a wave of proliferation that starts in the surviving hepatocytes next to the inner ring of dead cells and continues to the peripheral hepatocytes, finally restoring the characteristic micro-architecture of the lobule in a 7-day process. This model was used to systematically analyze the influence of parameters 1-5. Interestingly, coordinated cell orientation and cell polarity were identified to be the most critical parameters. Elimination led to destruction of the characteristic micro-architecture of the lobule and to a high degree of disorder characterized by hexagonal cell structures. Our model suggests that the ability of hepatocytes to realign after cell division by a process of coordinated cell orientation (model parameter 2) in combination with cell polarity (model parameter parameter 1) itself. (C) 2007 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved

Multipotential nestin and Isl-1 positive mesenchymal stem cells isolated from human pancreatic islets

Mesenchymal cells in the developing pancreas express the neural stem cell marker nestin and the transcription factor islet-1 (Isl-1). Using defined culture conditions we isolated on a single cell basis nestin producing cells from human pancreatic islets. These cells were immortalized with lentiviral vectors coding for telomerase and mBmi. They are positive for Isl-1 and nestin and have the potential to adopt a pancreatic endocrine phenotype with expression of critical transcription factors including Ipf-1, Isl-1, Ngn-3, Pax4, Pax6, Nkx2.2, and Nkx6.1 as well as the islet hormones insulin, glucagon, and somatostatin. In addition, they can be differentiated into human albumin producing cells in vivo when grafted into a SCID mouse liver. In accordance with a mesenchymal phenotype, the cells were also able to adopt adipocytic or osteocytic phenotypes in vitro. In conclusion, cultured pancreatic islets contain nestin and Isl-1 positive mesenchymal stem cells with multipotential developmental capacity

A refined characterisation of the NeoHepatocyte phenotype necessitates a reappraisal of the transdifferentiation hypothesis

Under certain culture conditions human peripheral blood monocytes may be induced to express phenotypic markers of non-haematopoietic lineages, including hepatocyte-defining traits. One such example, the NeoHepatocyte, was previously shown to express a broad panel of hepatocyte-like marker antigens and metabolic activities, both in vitro and following engraftment in the liver of immunodeficient mice. In this report, a refined description of NeoHepatocytes, with regard to their expression of xenobiotic-metabolising enzymes, morphology, hepatocyte marker expression and cell surface phenotype, is presented in comparison with human macrophages in defined states of activation. Contrary to prior assertions, it would seem more likely that NeoHepatocytes express particular hepatocyte-defining genes during a normal programme of macrophage differentiation rather than undergoing a process of transdifferentiation to become hepatocyte-like cells. © 2008 International Society of Differentiation.Dr. Hutchinson received funding from the RISET programme (Reprogramming the Immune-System for the Establishment of Tolerance) a multinational project financed by the European Commission. Other research funding was granted by Blasticon GmbH (Niemannsweg 13–17, 24063 Kiel, Germany).Peer Reviewe

Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases.

In recent years the interest in liver cell therapy has been increasing continuously, since the demand for whole liver transplantations in human beings far outweighs the supply. From the clinical point of view, transplantation of hepatocytes or hepatocyte-like cells may represent an alternative to orthotopic liver transplants in acute liver failure, for the correction of genetic disorders resulting in metabolically deficient states, and for late stage liver disease such as cirrhosis. Although the concept of cell therapy for various diseases of the liver is widely accepted, the practical approach in humans often remains difficult. An international expert panel critically discussed the recent published data on clinical and experimental hepatocyte transplantation and the possible role of stem cells in liver tissue repair. This paper aims to summarise the present status of cell based therapies for liver diseases and to identify areas of future preclinical and clinical research

ERBB2 induces an antiapoptotic expression pattern of Bcl-2 family members in node-negative breast cancer

Purpose: Members of the Bcl-2 family act as master regulators of mitochondrial homeostasis and apoptosis. We analyzed whether ERBB2 influences the prognosis of breast cancer by influencing the proapoptotic versus antiapoptotic balance of Bcl-2 family members. Experimental Design: ERBB2-regulated Bcl-2 family members were identified by inducible expression of ERBB2 in MCF-7 breast cancer cells and by correlation analysis with ERBB2 expression in breast carcinomas. The prognostic relevance of ERBB2-regulated and all additional Bcl-2 family members was determined in 782 patients with untreated node-negative breast cancer. The biological relevance of ERBB2-induced inhibition of apoptosis was validated in a murine tumor model allowing conditional ERBB2 expression. Results: ERBB2 caused an antiapoptotic phenotype by upregulation of MCL-1, TEGT, BAG1, BNIP1, and BECN1 as well as downregulation of BAX, BMF, BNIPL, CLU, and BCL2L13. Upregulation of the antiapoptotic MCL-1 [P = 0.001, hazard ratio (HR) 1.5] and BNIP3 (P = 0.024; HR, 1.4) was associated with worse prognosis considering metastasis-free interval, whereas clusterin (P = 0.008; HR, 0.88) and the proapoptotic BCL2L13 (P = 0.019; HR, 0.45) were associated with better prognosis. This indicates that ERBB2 alters the expression of Bcl-2 family members in a way that leads to adverse prognosis. Analysis of apoptosis and tumor remission in a murine tumor model confirmed that the prototypic Bcl-2 family member Bcl-xL could partially substitute for ERBB2 to antagonize tumor remission. Conclusions: Our results support the concept that ERBB2 influences the expression of Bcl-2 family members to induce an antiapoptotic phenotype. Antagonization of antiapoptotic Bcl-2 family members might improve breast cancer therapy, whereby MCL-1 and BNIP3 represent promising targets. Clin Cancer Res; 16(2); 451-60. (C)2010 AACR