Mechanism of action and membrane selectivity of a novel antimicrobial peptide

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016O número crescente de bactérias patogénicas resistentes aos antibióticos convencionais é atualmente uma das maiores preocupações, quer social como cientificamente. Com este cenário, a procura de alternativas terapêuticas tornou-se uma tarefa de enorme importância. Neste contexto, a investigação dedicada a péptidos antimicrobianos (AMP – antimicrobial peptides) tem aumentado, principalmente devido ao facto destas moléculas possuírem um grande espetro de ação contra uma variedade de agentes patogénicos (incluindo bactérias, vírus, fungos e parasitas). Mais especificamente, nos últimos anos, os esforços para sintetizar péptidos que possuam propriedades terapêuticas melhoradas em relação aos AMPs que se encontram na natureza têm aumentado. Com este objetivo em mente, estudos da relação entre atividade e propriedades físico-químicas dos AMP têm-se revelado de maior importância. Apesar de serem moléculas estruturalmente muito variadas, algumas propriedades têm sido descritas como comuns, entre elas, a anfipaticidade e a carga global positiva. O principal mecanismo de ação até hoje descrito é a permeabilização seletiva das biomembranas dos organismos alvo, apresentando baixa ou nenhuma toxicidade para as células do organismo. Vários modelos têm sido propostos na tentativa de justificar o modo de ação dos AMPs na permeabilização de membranas, quer pela formação de poros que leva à destruição das membranas, quer mediante uma atividade de degradação direta, a qual se definiu como sendo "do tipo detergente". Quanto à seletividade membranar, as forças eletrostáticas têm uma grande contribuição. Enquanto as membranas de bactérias são ricas em lípidos aniónicos, o que promove a interação com os AMPs (altamente catiónicos), as membranas das células do hospedeiro possuem um folheto externo neutro (zwitteriónico), explicando-se assim a seletividade celular observada para vários AMPs. No entanto, vários estudos sugerem que componentes específicos das membranas bacterianas podem também desempenhar um papel importante na seletividade dos péptidos. O EcAMP1R2 é um péptido recentemente desenvolvido com base em modelos computacionais de desenho racional de AMPs, que toma em consideração as propriedades do mesmo e que poderão aumentar a actividade antimicrobiana. Especificamente, este AMP demonstrou uma elevada atividade antimicrobiana contra E. coli, uma bactéria Gram-negativa, responsável por diversas patologias infecciosas. É relevante referir que este péptido não apresenta atividade contra células humanas. EcAMP1R2 tem uma carga global positiva (+5), numa sequência de 19 resíduos de aminoácidos. Em estudos preliminares observou-se que adota preferencialmente uma estrutura secundária em α-hélice, aquando da presença de sistemas membranares hidrofóbicos, contrariamente ao apresentado em solução aquosa, onde não se observou uma estrutura definida (random coiled). Ao longo deste trabalho, estudaram-se as propriedades de seletividade membranar, bem como os possíveis mecanismos de ação deste novo AMP, recorrendo-se a técnicas de espectroscopia de fluorescência e de dispersão de luz. Como sistemas modelo de membranas usaram-se lipossomas (LUVs; large unilamellar vesicles) e, para além destes, células de Escherichia coli, tendo em conta que a ação deste péptido tinha sido observada para membranas aniónicas de bactérias Gram-negativas. Por um lado, a variação de intensidade de fluorescência intrínseca do péptido (possível devido à presença de um resíduo de triptofano no C-terminal) foi seguida para quantificar a inserção do péptido em membranas e testar a especificidade de ação do mesmo, tendo em conta o sistema membranar usado. A acrilamida, uma molécula capaz de extinguir a fluorescência de resíduos de triptofano, foi usada de forma a avaliar o grau de internalização deste. Sondas fluorescentes foram também testadas, quer em lipossomas, quer em células bacterianas, de forma a ser possível analisar as alterações nas diferentes propriedades membranares que o péptido provoca. Entre essas propriedades, a fluidez, o empacotamento lipídico e o potencial dipolar de membrana foram estudadas, usando para tal DPH / TMA-DPH, Laurdano e di-8-ANEPPS como sondas repórter, respetivamente. Possíveis alterações no potencial superficial membranar de vesículas e de células bacterianas foram estudadas recorrendo-se a medidas de potencial-zeta. A dispersão dinâmica de luz permitiu estudar efeitos de agregação lipídica. Em todos os estudos realizados, a constituição lipídica das vesículas foi semelhante, tendo sido escolhido com base na ação do péptido. Vesículas de POPC foram estudadas como controlo negativo da ação do péptido. De forma a mimetizar a membrana bacteriana, lipossomas de POPC:POPG (70/30), POPE:POPG:CL (63/33/4) e POPE:POPG:CL:LPS (80/16/1/3) foram testadas, com as duas últimas constituições a mimetizar as membranas externa (OML) e interna (IML) de bactérias Gram-negativas, respetivamente. Vesículas lipídicas neutras enriquecidas em colesterol, POPC:Chol (70/30), foram também testadas, mimetizando células humanas saudáveis. Comparando os resultados obtidos para todas estas vesículas, foi-nos possível elucidar a contribuição relativa que os diferentes lípidos presentes nas membranas poderão ter nas interações péptido-membrana. Os resultados obtidos confirmaram a importância das forças eletroestáticas para a selectividade membranar do péptido EcAMP1R2, que se mostrou específico para membranas aniónicas, não tendo ação em membranas neutras. Esta especificidade pode ser deduzida directamente a partir dos resultados de partição membranar e de extinção de fluorescência, mas também observando que não promove quaisquer alterações das propriedades das membranas estudadas. Deste modo, justifica-se o facto de não ter qualquer efeito tóxico em células humanas, cujas membranas são maioritariamente neutras. Por outro lado, os resultados sugerem que a afinidade do péptido por vesículas aniónicas é maior nas que mimetizam a membrana interna e externa de bactérias. Este resultado sugere que a presença de lípidos específicos, como a cardiolipina e o LPS, poderá ser determinante para a acção do AMP. A presença de LPS surge aqui como essencial para que as interacções iniciais ocorram e promovam a interação péptido-membrana, já que é tanto nas vesículas de OML como nas células de E. coli que o potencial dipolar sofre mais alterações (os únicos sistemas testados na presença destas moléculas). Poder-se-á dizer que a membrana externa surge assim inicialmente como o alvo preferencial para este AMP. Relativamente às outras propriedades membranares estudadas, a ação do EcAMP1R2 não levou a nenhuma alteração de fluidez, independentemente do sistema estudado, sendo apenas possível observar uma pequena alteração do empacotamento lipídico em vesículas que mimetizam a membrana interna bacteriana (IML), sugerindo assim que este AMP é também capaz, após internalização, de atuar na membrana interna das bactérias. Curiosamente, estas vesículas foram as únicas que agregaram após um aumento crescente da concentração de péptido, embora não tenha sido seguido duma neutralização das cargas superficiais. Com base nestes dados, foi possível formular a hipótese que este AMP promove processos de fusão ou hemifusão membranar, após internalização ou destruição da membrana externa de bactérias Gram-negativas. Uma das explicações que poderá corroborar esta hipótese é o facto de lípidos com curvatura intrínseca, como é o caso da cardiolipina, favorecerem este tipo de processos. Concluindo, os resultados obtidos ao longo deste estudo sugerem que o péptido antimicrobiano EcAMP1R2 poderá ser um bom candidato para o tratamento de infeções causadas por bactérias Gram-negativas. Demonstrou-se que os modelos de membrana simples são aproximações de constituições lipídicas controláveis que permitem extrapolar, com uma boa aproximação, o modo de ação de moléculas biologicamente relevantes.Tackling antibiotic resistance is a worldwide priority. Antimicrobial peptides (AMPs) have been pointed as promising antimicrobial alternatives to conventional antibiotics. Most AMPs are cationic amphiphiles that kill bacteria by selectively attach and disrupt their negatively charged membranes. EcAMP1R2 is a newly designed cationic AMP with a high antimicrobial activity against Escherichia coli, without being cytotoxic to mammalian cells. Although the structure of EcAMP1R2 was well characterized in preliminary work, its activity is not well understood. In this work, we tried to elucidate the membrane selectivity and membrane activity of EcAMP1R2 in biomembrane models and Escherichia coli cells, by using optical spectroscopic techniques. Large unilamellar vesicles (LUVs) with different lipid compositions were used, including two mixtures mimicking the outer (OML) and the inner (IML) membranes of E. coli. Following the intrinsic fluorescence of the tryptophan residue of the peptide, it was observed that EcAMP1R2 discriminates between zwitterionic (mammalian-like) and anionic (bacterial-like) membranes. The effect of EcAMP1R2 on the physical properties of the membranes was monitored using diverse membrane probes. Finally, light scattering spectroscopy techniques were used to follow possible vesicle aggregation or changes in membrane surface charge due to the action of the peptide. Our results suggest that EcAMP1R2 internalizes deeply inside the outer membrane of E. coli, causing changes in the dipole potential, but little alterations on the surface charge. Moreover, EcAMP1R2 shows preferential affinity towards model membranes enriched in lipopolysaccharide, the major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria. Additionaly, EcAMP1R2 promotes the aggregation of IML vesicles, with which also demonstrates high affinity, without neutralizing the surface charge. This has led us to hypothesize that an increased selectivity of EcAMP1R2 towards cardiolipin molecules of these vesicles leads to a hemi-fusion or fusion process

Cat's Dilemma

We study a simple example of a sequential game illustrating problems connected with making rational decisions that are universal for social sciences. The set of chooser's optimal decisions that manifest his preferences in case of a constant strategy of the adversary (the offering player), is investigated. It turns out that the order imposed by the player's rational preferences can be intransitive. The presented quantitative results imply a revision of the "common sense" opinions stating that preferences showing intransitivity are paradoxical and undesired.

Quantum Cat's Dilemma: an Example of Intransitivity in a Quantum Game

We study a quantum version of the sequential game illustrating problems connected with making rational decisions. We compare the results that the two models (quantum and classical) yield. In the quantum model intransitivity gains importance significantly. We argue that the quantum model describes our spontaneously shown preferences more precisely than the classical model, as these preferences are often intransitive.

Do transitive preferences always result in indifferent divisions?

The transitivity of preferences is one of the basic assumptions used in the theory of games and decisions. It is often equated with rationality of choice and is considered useful in building rankings. Intransitive preferences are considered paradoxical and undesirable. This problem is discussed by many social and natural sciences. The paper discusses a simple model of sequential game in which two players in each iteration of the game choose one of the two elements. They make their decisions in different contexts defined by the rules of the game. It appears that the optimal strategy of one of the players can only be intransitive! (the so-called \textsl{relevant intransitive strategies}.) On the other hand, the optimal strategy for the second player can be either transitive or intransitive. A quantum model of the game using pure one-qubit strategies is considered. In this model, an increase in importance of intransitive strategies is observed -- there is a certain course of the game where intransitive strategies are the only optimal strategies for both players. The study of decision-making models using quantum information theory tools may shed some new light on the understanding of mechanisms that drive the formation of types of preferences.Comment: 16 pages, 5 figure

Development and Optimization of Computational Chemistry Algorithms

The challenges specific to the development of computational chemistry software are discussed. Selected solutions are presented, including examples of algorithmic optimizations and improved load-balancing for parallel calculations. A software framework for development of new quantum-chemical algorithms is proposed. Key design points are discussed. Optimization techniques are briefly described. Important implementation aspects, like automatic code generation, are highlighted