Structural Organization and Dynamics of Homodimeric Cytohesin Family Arf GTPase Exchange Factors in Solution and on Membranes

Membrane dynamic processes require Arf GTPase activation by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) with a Sec7 domain. Cytohesin family Arf GEFs function in signaling and cell migration through Arf GTPase activation on the plasma membrane and endosomes. In this study, the structural organization of two cytohesins (Grp1 and ARNO) was investigated in solution by size exclusion-small angle X-ray scattering and negative stain-electron microscopy and on membranes by dynamic light scattering, hydrogen-deuterium exchange-mass spectrometry and guanosine diphosphate (GDP)/guanosine triphosphate (GTP) exchange assays. The results suggest that cytohesins form elongated dimers with a central coiled coil and membrane-binding pleckstrin-homology (PH) domains at opposite ends. The dimers display significant conformational heterogeneity, with a preference for compact to intermediate conformations. Phosphoinositide-dependent membrane recruitment is mediated by one PH domain at a time and alters the conformational dynamics to prime allosteric activation by Arf-GTP. A structural model for membrane targeting and allosteric activation of full-length cytohesin dimers is discussed

Étude Structurale et Biochimique d'un Facteur d'Échange Atypique d'Arf

Les petites GTPases de la famille Arf, régulateurs majeurs du trafic membranaire, sont activé par plusieurs familles de facteurs d échange nucléotidiques (ArfGEFs). Les ArfGEFs jouent un rôle essentiel dans l intégration des signaux de régulation qui conduisent à l activation d Arf au niveau de compartiments cellulaires spécifiques, cependant les mécanismes par lesquels ils ciblent les Arfs activés aux membranes spécifiques et leur coordination avec l échange de nucléotide reste peu comprise. Nous utilisons ici la cristallographie et la reconstitution des activités ArfGEF sur des membranes artificielles pour analyser ces mécanismes pour un ArfGEF humain atypique, impliqués dans l endocytose de récepteurs et associé à l invasion tumorale dans de nombreuses cellules cancéreuses. Les membres de cette famille ont été décrits comme des GEFs spécifique d Arf6, et comporte un domaine de type PH après leur domaine Sec7. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous voulions savoir comment les isoformes Arf1 et Arf6 achevaient leurs fonctions dans la cellule. Arf1 et Arf6 sont très similaires: elles possèdent plus de 60% d identité de séquence, et des études structurales ont montré que la surface qu ils utilisent pour interagir avec leurs régulateurs et effecteurs est essentiellement identique en séquence et en structure. Cependant, elles ont des fonctions différentes dans la cellule et des propriétés différentes in vitro, pour lesquelles aucune donnée structurale n a donné d explications. Nous utilisons ici la cristallographie, le SAXS et la RMN pour comprendre la différence entre ces deux isoformes.Small GTPases of the Arf family, which are pivotal regulators of membrane traffic in eukaryotes, are activated by several families of guanine nucleotide exchange factors (ArfGEFs). ArfGEfs play a key role in processing upstream regulatory signals that lead to Arf activation onto specific subcellular compartments, yet the mechanisms by which they target activated Arfs to specific membranes and their coordination with nucleotide exchange remain poorly understood. Here we used X-ray crystallography and reconstitution of ArfGEF activities on artificial membranes to analyze these mechanisms for an atypical human ArfGEF, involved in receptor endocytosis and associated with tumour invasion in various cancer cells. Members of this family have been described as Arf6-specific GEFs, and carry a PH-like domain downstream their Sec7 domain. In a second part of the work we wanted to know how the isoforms Arf1 and Arf6 achieve exquisitely specific functions in cells. Arf1 and Arf6 are highly similar: they have over 60% sequence identity, and structural studies have shown that the surfaces they use to interact with regulators and effectors are essentially identical in sequence and structure. Yet, they have non-overlapping functions in cells. Arf1 is a major regulator of most aspects of vesicular traffic, while Arf6 is restricted to the plasma membrane where it acts at the crossroads of trafficking and cytoskeleton functions (D'Souza-Schorey and Chavrier 2006). Consistent with their cellular specificities, Arf1 and Arf6 also have distinctive biochemical properties in vitro, for which no straightforward structural explanation has been put forward. Here we used X-ray crystallography, synchrotron SAXS experiments and NMR to assess the difference between these two isoforms.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Caractérisation biochimique et structurale d'inhibiteurs des facteurs d'échange des petites protéines G arf et Rho

Les petites protéines G et les facteurs d échange sont des cibles thérapeutiques potentielles dans de nombreuses pathologies. Leur inhibition reste un véritable défi du fait de la complexité biochimique et structurale de la réaction d échange. C est pourquoi il est critique d identifier les talons d Achille pour pouvoir ensuite guider la découverte de nouveau inhibiteurs. Une étape importante est de caractériser le mécanisme des inhibiteurs actuellement connus et identifier, puis éventuellement manipuler, leur spécificité. A ce jour, six inhibiteurs des facteurs d échange sont connus. Dans ce travail, je me suis intéressé à la caractérisation biochimique et structurale de quatre des six inhibiteurs actuellement connus. J ai démontré, en combinant les données biochimiques et structurales disponibles et en utilisant des analogues de la BFA et des mutants d Arf et de Sec7, que la BFA possède une double spécificité. Cette spécificité peut être cartographiée à un seul acide aminé sur le domaine Sec7, mais elle semble dépendre de paramètres dynamiques chez Arf. J ai ensuite participé à la caractérisation de LM11, découvert par criblage in silico. J ai montré que LM11 inhibe l activation des Arf dans la cellule et j ai identifié deux résidus du domaine Sec7 et un D Arf qui permettent de moduler l inhibition par le LM11. Les constructions d Arf et de Sec7 établies pour ces deux études m ont permis d entreprendre une étude approfondie du mécanisme et de la spécificité in vitro de la SecinH3, un inhibiteur chimique découvert en 2007 par déplacement d aptamères. De façon remarquable, ces trois inhibiteurs ont des mécanismes différents et des spectres de spécificité croisés mais distincts. Mes travaux ont également porté sur l inhibition par un inhibiteur peptidique d un autre couple petite protéine G/GEF, RhoA et Tgat, impliqués dans un processus de cancer. Ces travaux suggèrent qu ils devrait être possible, dans le futur de cibler avec spécificité un couple de petite protéine G/GEF d intérêt thérapeutique.Small GTPases and exchange factors are potential therapeutic targets in many diseases. Their inhibition is a challenge because of the biochemical and structural complexity of the exchange reaction. It is therefore critical to identify Achilles heel that will help the discovery of new inhibitors. An important step is to characterize the inhibition mechanism and the specifity of known inhibitors. To date, six inhibitors of GEFs are known. In this work, I focused on the biochemical and structural characterization of four of them : BFA, LM11, SecinH3 and Tripa. In the first part of the work, I used Arf and Sec7 mutants and a BFA analogue to demonstrate the dual specificity of BFA for its GTPases and GEF targets. This specificity depends on a single Sec7 residue and may involve dynamics features of Arf. I was then involved in the characterization of LM11, an ArfGEF inhibitor discovered by in silico screening. I showed that LM11 inhibits Arf activation in cells and identified two residues in the Sec7 domain and one in Arf that are important for its activity. By using Arf and Sec7 constructs established for the BFA and LM11 studies. I went on to characterize the inhibition mechanism and specificity of SecinH3, an inhibitor of the cytohesin family of ArfGEFs discovery in 2007. Remarkably, we find that these three inhibitors act according to different mechanisms, and have different pattern of specificity for their Arf and ArfGEF targets. I finally studies the inhibition by an peptidic inhibitor of the activation of RhoA by an oncogenic RhoGEF called Tgat. These studies, altogether, suggest that GTPases and GEFs are suitable targets for inhibition, and that it should be possible to discovery inhibitors that target specific small GTPase/GEF pairs involved in diseases.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Rôle de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine dans la réplication du VIH-1

Rôle de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine dans la réplication du VIH-1. La transcriptase inverse codée par le génome du VIH-1 utilise l ARNt3Lys de la cellule-hôte pour amorcer la transcription inverse de son génome ARN en ADN proviral. Il existe trois isoformes de la lysyl-ARNt synthétase humaine (LysRS), toutes les trois codées par le même gène : les formes cytoplasmique (cLysRS), mitochondriale (mLysRS) et pré-mitochondriale (pmLysRS). L'espèce pmLysRS est le précurseur de mLysRS qui est clivé après import dans la mitochondrie. Il a été montré au laboratoire que la LysRS mitochondriale est sélectivement encapsidée dans les particules du VIH-1 et pourrait donc être responsable du transport des ARNtLys au cours du processus d encapsidation. Au cours de ce travail, nous avons exprimé, purifié, et analysé les capacités de ces trois formes enzymatiques à former un complexe avec l'ARNt. Les résultats décrits dans ce mémoire montrent que les formes mLysRS et pmLysRS purifiées ont la capacité d'aminoacyler l ARNtLys aussi bien que la forme cytoplasmique de l'enzyme. Nous avons recherché quelles protéines virales pourraient s'associer à la LysRS et à l'ARNtLys pour former le complexe d'encapsidation de l'ARNtLys,3. Par le système du double-hybride, nous avons montré que la protéine Gag n interagit avec aucune des trois formes de LysRS. Mais nous avons observé que toutes les isoformes de LysRS interagissent avec Pol, un précurseur polyprotéique de HIV-1. Ces données montrent que mLysRS/pmLysRS pourrait former le complexe d'encapsidation de l'ARNt par interaction avec GagPol, et servirait à transporter l'ARNtLys,3. Nos resultats suggèrent aussi qu'un autre facteur est impliqué dans la formation d'un complexe spécifique entre Pol et mLysRS ou pmLysRS pour l encapsidation de l'ARNt dans las particules virales. Caractérisation de l inhibition d un nouveau mutant de la GTPase Arf. Les petites protéines G de la famille Arf sont des régulateurs majeurs du trafic cellulaire chez les eukaryotes. Il a été montré récemment que les protéines Arf sont impliquées dans des cancers ou bien des maladies infectieuses lorsqu'elles sont dérégulées. Les Arfs sont activées par l échange GDP/GTP, échange stimulé par leurs facteurs d'échange nucléotidique (GEFs). Les GEFs sont donc de bons candidats pour bloquer spécifiquement les voies de signalisation correspondantes. Le premier inhibiteur de GEF connu a été le macrolide fongique bréfeldine A (BFA). Son mécanisme d inhibition a été appelé inhibition interfaciale et constitue un concept prometteur pour la découverte de nouveaux inhibiteurs. Grâce à ce concept, la petite molécule inhibitrice LM11 a été découverte par criblage in silico en utilisant la structure cristallographique du complexe Arf1-GDP/ARNO qui a été précédemment résolue dans notre laboratoire. La fixation de LM11 dans la cavité criblée a été précédemment analysée par des mutations d ARNO et par RMN HSQC d Arf1-GDP. Dans ce travail, j ai étudié la contribution de Lys38 dans Arf1, résidu dont le déplacement chimique est affecté en RMN HSQC par la présence de l inhibiteur LM11. J ai utilisé la mutagenèse dirigée pour construire un nouveau mutant d Arf1, Arf1K38A. Ce mutant a été exprimé, purifié et analysé pour son activité d échange et sa sensibilité à l inhibiteur. On a montré que le résidu K38 d Arf1 est crucial pour le mécanisme d inhibition de LM11, mais reste sensible à la BFA. Dans la deuxième partie de mon travail, j ai construit, exprimé et purifié la forme entière d Arf4, un membre de la classe II des Arfs, dont les propriétés biochimiques sont mal caractérisées.Mitochondrial isoform of human LysRS and its role in HIV-1 replication. The HIV-1 reverse transcriptase (RT) uses the host cellular tRNALys,3 as a primer for reverse transcription of the viral genomic RNA into dsDNA. Human lysyl-tRNA synthetase (LysRS) occurs in three isoforms coded by one gene: the cytoplasmic (cLysRS), mitochondrial (mLysRS) and premitochondrial (pmLysRS) forms of LysRS. pmLysRS is the precursor of mLysRS targeted to the mitochondria. LysRS is hijacked with tRNALys,3 into the HIV-1 viral particles. In our group, we showed that mitochondrial LysRS, but not its cytoplasmic counterpart, is found in the viral particles. In order to further investigate the role of mLysRS and also of pmLysRS in reverse transcription of the RNA genome of HIV-1, we expressed, purified and studied the kinetic parameters for all human LysRS isoforms in order to assess their tRNA-binding capacities. We observed that not only cLysRS but also both mLysRS and pmLysRS could efficiently aminoacylate tRNALys,3. We searched for viral proteins that could associate with LysRS and tRNALys to form the tRNA-packaging complex. Using the two-hybrid system, we identified that all three isoforms of LysRS are able to interact with Pol, a polyprotein precursor of HIV-1, but not with Gag protein as was reported previously. These data suggest that mLysRS/pmLysRS could form the tRNA-packaging complex with GagPol protein and serve as a carrier of tRNALys,3. In addition, our data suggest that it might exist additional factors required to produce a specific tRNA-packaging complex between Pol and mLysRS or pmLysRS. Characterisation of an Arf mutant with differential responses to GEF inhibitors. The small GTP-binding protein Arf is a major regulator of cellular traffic in eukaryotes. It has recently been shown to be deregulated in several human diseases, including cancer and infections. Arf proteins are activated by GDP/GTP exchange, which is stimulated by their guanine nucleotide exchange factors (GEFs). GEFs are therefore attractive candidates to interrupt specifically the corresponding signalling pathways. The fungal macrolide brefeldin A (BFA) was the first known GEF inhibitor. Its inhibition mechanism was called the interfacial inhibition and became a promising way for drug discovery. A small molecule inhibitor called LM11 was subsequently discovered by in silico screening using the crystal structure of the Arf1-GDP/ARNO complex previously solved in the laboratory. The binding site of the inhibitor to the target pocket was previously analyzed by mutations in ARNO and by NMR HSQC of Arf1-GDP. In this work, we further investigated the contribution of Lys38 in Arf1, which was shown by NMR to be affected by the binding of the inhibitor. I used site-directed mutagenesis to construct a novel mutant of Arf1, Arf1K38A. The mutant protein was then expressed, purified to homogeneity and analyzed for its exchange properties and sensitivity to inhibitors. We find that the K38 residue of the Arf1 is crucial for LM11 inhibition mechanism, but remains sensitive to BFA. In a second part of this work, I constructed, expressed and purified full-length form of Arf4, a member of the Arf family whose biochemical properties are poorly characterized.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Allosteric inhibition of the guanine nucleotide exchange factor DOCK5 by a small molecule

International audienc

APTAMER-DERIVED PEPTIDES AS POTENT INHIBITORS OF THE ONCOGENIC RHOGEF TGAT

Running title: Targeting the Tgat oncogene with peptidic inhibitor

Pharmacological inhibition of Dock5 prevents osteolysis by affecting osteoclast podosome organization while preserving bone formation

International audienceOsteoporosis is caused by excessive activity of bone-degrading osteoclasts over bone-forming osteoblast. Standard antiosteolytic treatments inhibit bone resorption by inducing osteoclast loss, with the adverse effect of hindering also bone formation. Formation of the osteoclast sealing zone requires Dock5, a guanine nucleotide exchange factor for the small GTPase Rac, and C21, a chemical inhibitor of Dock5, decreases bone resorption by cultured osteoclasts. Here we show that C21 directly inhibits the exchange activity of Dock5 and disrupts osteoclast podosome organization. Remarkably, C21 administration protects mice against bone degradation in models recapitulating major osteolytic diseases: menopause, rheumatoid arthritis and bone metastasis. Furthermore, C21 administration does not affect bone formation and is not toxic. Our results validate the pharmacological inhibition of Dock5 as a novel therapeutic route for fighting osteolytic diseases while preserving bone formation