Wound response and pigmentation pattern formation

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular Humana). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Os animais são revestidos pela epiderme e quando esta sofre algum dano tem de ser rápida e eficazmente reparada. O processo de cicatrização é complexo e absolutamente vital e requer a activação de um panóplia de vias de sinalização relacionadas com a coagulação, reparação de tecidos e imunidade. Em muitos animais a epiderme cicatrizada adquire uma coloração diferente. Por exemplo nos artrópodes a coagulação da hemolinfa está associada ao aparecimento de uma marca escura, a qual é consequência da activação da via de sinalização da biosíntese da melanina. Nos insectos esta via é extremamente importante na defesa contra possíveis microorganismos invasores assim como na cicatrização de feridas e na pigmentação do corpo dos insectos. Um caso muito interessante onde uma ferida origina um padrão de cores, é o da borboleta Bicyclus anynana. Nesta borboleta uma ferida nas asas da pupa em desenvolvimento pode conduzir ao aparecimento de um padrão de cores à volta da ferida, os quais se assemelham aos padrões nativos desta borboleta – os ocelos (anéis de cores concêntricos em que o centro, focus, é branco). Os mecanismos moleculares que estão na base da formação destes padrões são ainda desconhecidos. No entanto, é provável que a formação dos padrões nativos e dos induzidos por ferida tenha genes e vias de sinalização em comum. Neste estudo nós procurámos saber quais os mecanismos genéticos, a estrutura celular, e a expressão genética associada a estes padrões de pigmentação induzidos por ferida em B. anynana. Numa primeira experiência nós induzimos feridas em pupas em condições de esterilidade e não esterilidade e verificámos que o número e o tamanho dos padrões induzidos por ferida não diferia entre os dois grupos. Assim concluímos que a formação dos padrões induzidos por ferida nas asas de B. anynana não é dependente do processo de infecção, o qual induz a activação das vias de sinalização associadas à imunidade e ao combate a microorganismos. Este resultado sugere que os genes e as vias de sinalização, que possam ser partilhados pela formação de padrões nativos e induzidos por ferida, são maioritariamente relacionados com os mecanismos de reparação de tecidos. No entanto, uma ferida mesmo em condições de esterilidade pode activar (em baixos níveis) as mesmas vias de sinalização, o que pode ser suficiente para activar a formação dos padrões induzidos por feridas. A quantificação dos níveis de expressão de genes associados à resposta imune, em asas feridas de B. anynana em condições de esterilidade e não esterilidade, poderá esclarecer a extensão da activação destas vias após a indução de feridas estéreis. Nesta experiência, foi também possível concluir que as fêmeas são mais susceptíveis a formar mais e maiores padrões induzidos por ferida que os machos. Esta diferença pode dever-se ao facto de existir heterocronia e dimorfismo sexual entre os géneros. As horas mais propícias para a formação de padrões induzidos por ferida em B. anynana são entre as 12 e as 18 horas após pupação. Um estudo extensivo onde o intervalo de tempo ideal, quer para fêmeas quer para machos, fosse mais reduzido (por exemplo 2 em vez das actuais 6 horas) seria útil para perceber a heterocronia entre os géneros e entender melhor as diferenças observadas. As feridas induzidas no terceiro compartimento formaram mais padrões que as induzidas no quarto compartimento. Isto sugere que existe compartimentalização da resposta à ferida ao longo do eixo anterior-posterior da asa em desenvolvimento da B. anynana. O estudo destes padrões em mutantes ou linhas de selecção artificial com diferentes propriedades na epiderme das asas poderia ajudar a perceber a extensão da compartimentalização da resposta às feridas nas asas desta borboleta. Numa segunda experiência tentámos perceber qual a estrutura celular da asas em desenvolvimento, assim como as alterações que uma ferida provoca na mesma. Verificámos que, à semelhança de outras borboletas, as células que vão produzir as escamas, estruturas onde os pigmentos serão depositados numa fase mais tardia do desenvolvimento, são determinadas por um mecanismo denominado de inibição lateral por Notch. Este processo ocorre pelo menos entre as 10 e 16 horas após pupação. Para saber a extensão do intervalo de tempo total deste processo será necessário explorar a expressão de Notch em horas inferiores e superiores às aqui testadas. Nos foci dos futuros ocelos detectámos que existiam mais células produtoras de escamas, as quais se organizavam de uma forma diferente do resto do epitelio. A forma como estas células estão organizadas pode ser crucial para a formação do ocelo. Para saber se esta organização é essencial para a formação dos ocelos poder-se-iam fazer feridas no focus às 6 horas após pupação (levam à não formação do ocelo) e às 12 horas (levam à formação de um ocelo maior) e perceber como é que estas feridas afectam a organização das células no focus. No local das onde as feridas foram feitas verificou-se um aumento do número de células. Este aumento do número de células em tecidos lesados é comum nos animais e é indicativo de uma resposta inflamatória. Apesar de ser claramente visível um aumento do número de células à volta do local da ferida, com esta experiência não nos foi possível distinguir entre proliferação, divisão e migração celular. Futuras experiências deverão ser realizadas para testar a presença de marcadores de proliferação e divisão celular assim como marcadores para as células da hemolinfa. Uma hipótese que considerámos foi o facto do aumento do número de células no local da ferida ser suficiente para induzir a formação dos padrões induzidos por ferida. Para testar esta hipótese será necessário adquirir mutantes ou técnicas para induzir uma redução na capacidade de proliferação e migração celular e depois investigar nestes indivíduos se a capacidade de formação de padrões induzidos por ferida é menor que nos indivíduos wild type. Em asas tardias de pupa nós observámos que os pigmentos dourados dos ocelos e dos patrões induzidos por ferida eram depositados nas escamas ao mesmo tempo (ou em tempos muito semelhantes). O mesmo não se verificou para os pigmentos pretos, onde apesar de já serem visíveis nos padrões nativos da asas nunca foram detectados à volta do local da ferida. No entanto esta heterocronia na deposição do pigmento preto nos padrões nativos e induzidos por ferida é difícil de provar, porque não é possível, num estudo desta natureza, ter a certeza qual seria o fenótipo adulto. Um estudo mais pormenorizado que contemplasse mais tempos experimentais e mais indivíduos, assim como outros mutantes ou linhas de selecção com diferentes cores de padrões das asas, ajudaria a esclarecer esta questão. Na terceira experiência a expressão de vários genes relacionados com a cicatrização de feridas, formação dos ocelos e a biosíntese da melanina foi comparada nos padrões nativos e à volta das feridas. Nenhum dos genes testados foi detectado à volta do focus dos ocelos e apenas a expressão do gene ple foi detectada à volta das feridas. O aumento da expressão do ple pode indicar a activação da via de sinalização ERK/MAPK, a qual está implicada na regulação da transcrição de componentes da epiderme assim como na morte, proliferação e diferenciação celular. Os dois últimos processos estão de acordo com o aumento do número de células observado na segunda experiência, deste modo esta via de sinalização pode ter um papel fundamental na resposta inflamatória que se segue a uma ferida e também na formação dos padrões induzidos por ferida. No entanto, serão necessários mais estudos para comprovar a proliferação ou migração celular à volta da ferida. Resumindo, com este projecto foi possível concluir que: - a formação dos padrões induzidos por ferida não é dependente do processo de infecção; - as fêmeas são mais sensíveis a formar padrões induzidos por ferida que os machos; - a resposta à ferida varia consoante a posição onde esta é induzida, o que sugere compartimentalização da asa na sua capacidade de reposta à ferida; - 10 horas após pupação a determinação das células que vão ser as produtoras de escamas já está a ocorrer; os foci dos ocelos tem uma organização celular que é diferente do resto da asa; - as feridas nas asas em desenvolvimento induziram um aumento do número de células à volta das mesmas; - o pigmento preto dos padrões induzidos por ferida nunca foi detectado, o que pode indicar que a sua síntese nos padrões induzidos por ferida é posterior à dos padrões nativos; - a expressão do gene ple está aumentada à volta das feridas, o que sugere a activação da via de sinalização ERK/MAPK a qual pode ser responsável pela activação da proliferação celular à volta feridas.Animals are protected by an outer barrier (epidermis) that, when injured, must be rapidly and efficiently repaired. The healing of the epidermis is a vital and complex process which triggers pathways associated with scab formation, tissue repair, and immunity. In a wide range of animals, the healed epidermis can display new pigmentation patterns. In arthropods the blood (hemolymph) coagulation leads to the formation of a black-brown mark, which results in activation of melanin biosynthesis pathway. For insects, melanogenesis is vital for defense against pathogens, wound healing and body coloration. An interesting case of wound-induced pigmentation patterns occurs in the butterfly Bicyclus anynana. Damaging on the pupal wing epidermis can result in formation of rings of colour resembling those formed in the native concentric colour rings - eyespots. The molecular underpinnings of this process are largely unknown. However, the genes and pathways involved in development of native eyespots can be also involved in the wound-induced patterns. Here we studied the genetic mechanisms, the cellular dynamics and the gene expression associated with the wound-induced pigmentation patterns in B. anynana. We could conclude that the wound-induced pattern formation does not depend of infection process; the females are more sensitive to the wound signals than males; the wound response in the two wing compartments analyzed were different, which indicates the compartmentalization of the wing epithelium; 10 hours post pupation the differentiation of scale forming cells has already started; the eyespot foci have a different cell organization; the wound induces a local increase in cell number; the black pigment of the wound-induced patterns could be synthesized after the black pigment of the native eyespots; ple is up-regulated around the wound site 4 hours post wounding and ERK/MAPK pathway could be activating cell proliferation at the wound site

Microsatellite markers associated with genes expressed in developing wings of Bicyclus anynana butterflies

Deriving useful microsatellite markers in lepidopterans has been challenging when relying on scans of genomic DNA libraries, presumably due to repetitiveness in their genomes. We assayed 96 of 320 microsatellites identified in silico from a collection of Bicyclus anynana ESTs, in 11 independent individuals from a laboratory population.From the 68 successful assays, we identified 40 polymorphic markers including 22 with BLAST-based annotation. Nine of 12 selected polymorphic markers tested in a panel of 24 wild-caught individuals converted to successful assays and were all polymorphic. We discuss how microsatellite discovery in ESTs is an efficient strategy with important attendant advantages

The origin and development of novelty: eyespots and immunity

The infinitude of forms across living beings always fascinated scientists and laymen alike. Phenotypic variation is the raw material for natural selection and is transversal in biological systems. Evolutionary novelties are lineage specific traits with adaptive value. How such traits arise in organisms is still an open question. To understand this process we used the butterfly eyespots as a model, which are evolutionary novelty. Our testing hypothesis was that butterflies had rewired ancient genetic mechanisms used for the wound-response to develop eyespots, co-option. The major fact supporting this hypothesis is that wounding an early pupal wing can develop an eyespot-like pattern around wound site. This pinpoints the existence of genetic and cellular commonalities between eyespot development and wound response.(...)Fundação Calouste Gulbenkia