Oxidative protein modification of the temporal bone tissue in chronic otitis media

Aim. To study the role of oxidative protein modification of bone tissue proteins in the formation of destruction of temporal bone structures in chronic otitis media. Methods. The study included 139 patients aged 16-75 years with a verified diagnosis of chronic otitis media, who are candidates for surgical treatment. Depending on the method of surgical treatment, patients are divided into four groups (by nosology and complications and reoperations): patients with tubotympanic otitis media and epitympanic antral otitis, without complications and with local or intracranial complications, after reconstructive sanitizing ear surgery. The state of the processes of oxidative modification of proteins was evaluated in the bone tissue of the middle ear cavities, obtained intraoperatively, by the content of carbonyl products with the use of spectrophotometry. The data were processed by descriptive statistics and were presented in the form of a median and a range between quartiles with an estimate of the reliability of the intergroup differences by the Mann-Whitney U-criterion. Results. A comparison of the indicators characterizing the oxidative modification of bone tissue proteins of the temporal bone in patients with complicated and recurrent forms of chronic otitis media demonstrates a greater degree of free radical destruction of proteins, primarily markers of early stages of protein damage and an increase of aldehyde products, both at the basal level and in response to induction in a complicated course of the disease. Conclusion. The obtained data allow drawing a conclusion about a high level of oxidative stress in bone tissue in destructive forms of chronic otitis media accompanied by relapses and complications, and about the perspectives of antioxidant pre-operative use taking into account the features of oxidative stress in bone tissue in patients with chronic otitis media

Genetic basis of anthracyclines cardiotoxicity: Literature review

The purpose of this review was to systematize data on molecular genetic markers of increased risk of cardiotoxic effects, as well as to search for risk and protective variants of candidate genes. Today, the therapy of malignant neoplasms is based on the use of anthracyclines – drugs of the cytostatic mechanism of action. Along with their effectiveness, these drugs can have a cardiotoxic effect on cardiomyocytes by increasing the amount of reactive oxygen species and disrupting mitochondrial biogenesis. Pathological disorders lead to an increased risk of myocardial dysfunction and a number of other cardiovascular pathologies in patients receiving chemotherapy using anthracyclines. The cardiotoxic effect of anthracyclines leads to cardiomyopathy, heart failure, myocardial infarction, and thrombosis. Early detection of cardiotoxic damage leads to reducing the negative effects of these drugs due to changes in chemotherapy tactics. It is known that the risk of cardiotoxic myocardial damage is genetically determined and controlled by more than 80 genes. In this review, the description of basic molecules such as ATP-binding cassette transporters and solute carrier family (SLC transporters), carbonyl reductase, molecules of antioxidant defense, xenobiotic and iron metabolism was performed. In addition, a special attention is paid to the study of epigenetic and post-translational regulation. The available data are characterized by some inconsistency that may be explained by the ethnic differences of the studied populations. Thus, a more detailed research of various ethnic groups, gene-gene interactions between potential candidate genes and epigenetic regulation is necessary. Thus, understanding the contribution of genetic polymorphism to the development of cardiotoxicity will help to assess the individual risks of cardiovascular pathology in patients with various types of cancer, as well as reduce the risk of myocardial damage by developing individual preventive measures and correcting chemotherapy

Polymorphism of inflammatory system genes in the pathogenesis of rheumatic heart disease

Aim. To assess the contribution of polymorphic variants of inflammatory response genes to the predisposition to rheumatic heart disease.Material and methods. Using real-time polymerase chain reaction, we analyzed the prevalence of 18 polymorphic variants of 8 genes involved in the inflammatory process in 251 patients with rheumatic heart disease and 300 healthy donors.Results. We found that homozygous TT genotypes of rs1800871 (IL10) (p=0,02) and TT rs1800872 (IL10) polymorphisms (p=0,027), as well as TT genotypes of CRP gene (rs1205) (p=0,015) and GG genotypes of rs375947 (IL12RB) (p=0,037) are "risky" and associated with the development of rheumatic heart disease.Conclusion. Associations of polymorphic variants rs1800871 and rs1800872 of the IL10 gene, rs1205 of the CRP gene, and rs375947 of the IL12RB gene can be an important link in the pathogenesis of rheumatic heart disease and can later be used as biological markers for a personalized assessment of the disease risk

Генетические макеры системной воспалительной реакции в кардиохирургии (обзор)

The systemic inflammatory response syndrome is a typical systemic reaction to tissue injury and an important factor for structural and functional regeneration of the damaged tissue. The systemic inflammatory response syndrome developed in patients in the postoperative period after cardiac surgeries is a natural body reaction; however, in some cases there is an excessive generation of pro-inflammatory factors that can change the nature of inflammation and worsen the tissue damage. The massive release of inflammatory mediators leads to dysfunction of various organs and systems and can become one of main causes of lethal outcomes in the postoperative period. There is evidence of the contribution of the systemic inflammation to the pathogenesis of atherosclerosis. Therefore, an assessment of patient’s susceptibility to the systemic inflammatory response may contribute to predicting disease risks and severity as well as choosing a specific therapy for a given patient. This review analyzes the information about the contribution of the polymorphism of genes encoding cytokines and proteins involved in the pathogenesis of the systemic inflammatory response in the development of individual susceptibility to the non-infectious systemic inflammatory response in patients after cardiac surgeries, as well as in modification of its severity and consequences.Системная воспалительная реакция (СВР) — типовая системная реакция организма на тканевое повреждение и необходимое условие структурно-функционального восстановления поврежденной ткани. СВР, возникающая у пациентов в интра- и послеоперационном периодах кардиохирургических вмешательств, является естественной реакцией организма, однако в ряде случаев имеет место чрезмерная генерация провоспалительных импульсов, изменяющая характер воспаления и усугубляющая тканевое повреждение. Массивное высвобождение медиаторов воспаления приводит к дисфункции различных органов и систем и может служить одной из основных причин летальных исходов в послеоперационном периоде. Существуют свидетельства роли системного воспаления в патогенезе атеросклероза. Таким образом, оценка предрасположенности пациентов к характеру развивающегося в послеоперационном периоде системного воспалительного ответа поможет прогнозировать риск развития послеоперационных осложнений воспалительного генеза или тяжесть их течения, и подобрать специфическую терапию для конкретного пациента. В данном обзоре анализирована информация о роли полиморфизма генов, кодирующих цитокины и белки, вовлеченные в патогенез системного воспалительного ответа, в формировании индивидуальной предрасположенности к развитию системного воспаления неинфекционного генеза у пациентов, перенесших кардиохирургические вмешательства, а также в модификации его тяжести и последствий

Параметры праймеров, коррелирующие с коэффициентом детерминации и эффективностью количественной полимеразной цепной реакции

We performed a correlation analysis between primer parameters and qPCR efficiency/coefficient of determination in two independent samples from in vitro functional experiments.Primer parameters do not define qPCR efficiency and coefficient of determination significantly if primers are designed according to the optimised PRIMER-BLAST settings.Aim. To find the correlation between the primer parameters, efficiency, and coefficient of determination (R2 ) in quantitative polymerase chain reaction (qPCR) conditions.Methods. Upon RNA isolation from primary human coronary artery endothelial cells, we performed reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) utilising SYBR Green chemistry to measure the expression of the following genes: IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR, VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3, PXDN. Primers were designed employing Primer-BLAST software using optimised settings. For the correlation analysis, Spearman's rank correlation coefficient was applied (GraphPad Prism).Results. Coefficient of determination correlated with the primer pair rating by Beacon Designer, amplicon melting temperature, and GC content in the reverse primer. Reaction efficiency did not correlate with the Beacon Designer rating, yet being associated with length and GC content of the reverse primer. Abovementioned correlation coefficients ranged from 0.4 to 0.5 or from -0.4 to -0.5 indicative of moderate positive or negative correlation. Other parameters did not affect reaction efficiency and coefficient of determination. Conclusion Primer parameters do not define qPCR efficiency and coefficient of determination significantly if primers are designed according to the optimised PRIMER-BLAST settings. Проведен корреляционный анализ параметров праймеров и эффективности и коэффициента детерминации кПЦР на двух независимых массивах экспериментальных данных.При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.Цель. Выявить, существует ли корреляция между параметрами праймеров, эффективностью и коэффициентом детерминации количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).Материалы и методы. Выделение РНК производили из первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии с последующим синтезом одноцепочечной комплементарной ДНК при помощи обратной транскрипции. Методом кПЦР с детекцией результата в режиме реального времени (флуоресцентный краситель SYBR Green I) определяли экспрессию следующих генов: IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR, VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3, PXDN. Праймеры разработаны в программе Primer-BLAST. Корреляционный анализ по Спирмену выполнен в программе GraphPad Prism.Результаты. Коэффициент детерминации коррелировал с количественной оценкой качества праймеров, разработанных в программе Beacon Designer, температурой плавления ампликона и содержанием гуанина – цитозина в обратном праймере. Эффективность кПЦР, напротив, не коррелировала с количественной оценкой качества созданных в Beacon Designer праймеров, но коррелировала с длиной, а также процентным содержанием GC в обратных праймерах. Все указанные коэффициенты корреляции находились в диапазоне от 0,4 до 0,5 либо от -0,4 до -0,5, отражая корреляционную связь средней силы. В то же время остальные параметры (как для пар, так и отдельно прямого и обратного праймеров) не влияли на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.Заключение При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

Оценка экспрессии провоспалительных цитокинов в гладкомышечных клетках коронарной артерии, экспонированных мутагеном алкилирующего механизма действия

Background. It is known that DNA damage in smooth muscle cells can trigger their clonal expansion and transformation into foam cells. Thus, the study of the molecular genetic mechanisms of the vascular smooth muscle cells response to genotoxic exposure is important and relevant in the context of an in-depth understanding of atherogenesis.Aim. To study mRNA level and concentration of proinflammatory cytokines IL6 and IL8 in the human coronary artery smooth muscle cells exposed to alkylating mutagen.Methods. Gene expression signature of studied cytokines in the human coronary artery smooth muscle cells was accessed by quantitative polymerase chain reaction in the two timepoints – immediately after six-hour exposure to mitomycin C (point 1) and after six-hour exposure to mitomycin C followed by 24 hours of cells being cultivated on mitomycin C-free cell growth medium (point 2). Smooth muscle cells cultured according to the above scheme without genotoxin were used as controls. HPRT1, GAPDH and B2M were used as the reference genes. Gene expression level was calculated by ΔCt method. IL6 and IL8 concentration was evaluated in the culture media in points 1 and 2 by enzyme-linked immunosorbent assay. Statistical analysis was performed in GraphPad Prism 9 software.Results. Immediately after mutagenic exposure (point 1) we discovered no significant changes in the expression level of IL6 and IL8 in the mitomycin C exposed smooth muscle cells compared to controls. Removal of mutagen increased expression of IL6 and IL8 in the experimental group (0,36- and 0,67-fold, respectively). At the same time, we discovered no significant differences in the studied cytokines concentration in the culture medium of mutagen-exposed cells compared to the nonexposed controls.Conclusion. Genotoxic stress in human coronary artery smooth muscle cells exposed to alkylating mutagen (mitomycin C) leads to differential expression but not secretion of proinflammatory cytokines IL6 and IL8. Thus, exposure of smooth muscle cells to mitomycin C do not trigger their proinflammatory phenotype. Актуальность. Известно, что повреждение ДНК гладкомышечных клеток может быть триггером их клональной экспансии и трансформации в пенистые клетки. Таким образом, изучение молекулярно-генетических механизмов ответа гладкомышечных клеток сосудов на генотоксическое воздействие представляется важным и актуальным в контексте углубленного понимания механизмов атерогенеза.Цель. Изучить характер изменения уровня мРНК и концентрации провоспалительных цитокинов IL6 и IL8 в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека, культивируемых в условиях генотоксической нагрузки.Материалы и методы. Уровень генной экспрессии изучаемых цитокинов в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в двух временных точках – непосредственно после 6 ч экспозиции клеток митомицином С (точка 1) и после 6 ч экспозиции мутагеном с последующими 24 ч культивирования клеток в чистой культуральной среде (точка 2). Контролем служили гладкомышечные клетки, культивированные по вышеуказанной схеме без генотоксической нагрузки. В качестве референсных генов использовали HPRT1, GAPDH и B2M. Уровень экспрессии генов интереса рассчитывали по методу ΔCt. Концентрацию IL6 и IL8 в культуральной среде определяли с помощью иммуноферментного анализа в точках 1 и 2. Статистический анализ полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 9.Результаты. Непосредственно после мутагенного воздействия (точка 1) не выявлено изменения уровня экспрессии генов IL6 и IL8 в гладкомышечных клетках, экспонированных митомицином С, по сравнению с неэкспонированным контролем. После удаления из культур мутагена в экспериментальной группе отмечено снижение уровня мРНК генов IL6 и IL8 по сравнению с контролем (кратность изменения экспрессии составила 0,36 и 0,67 соответственно). При этом достоверных различий концентрации изученных цитокинов в культуральной среде гладкомышечных клеток, экспонированных митомицином С, по сравнению с контролем не выявлено.Заключение. Генотоксический стресс в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека, вызванный алкилирующим мутагеном митомицином С, приводит к изменению профиля генной экспрессии, но не концентрации провоспалительных цитокинов IL6 и IL8. Таким образом, воздействие митомицина С на гладкомышечные клетки не приводит к формированию ими провоспалительного фенотипа

Случай спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода в культуре первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека

Highlights. Spontaneous endothelial-to-mesenchymal transition of primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) is characterized by an acquired expression of SNAI2 and TWIST1 genes, loss of endothelial markers and transcription factors (CD31/PECAM1, VE-cadherin, and ERG transcription factor), pronounced expression of S100A4 and ACTA2 genes, and active production of type I collagen, a major component of the extracellular matrix.An optimal algorithm to detect endothelial-to-mesenchymal transition includes gene expression profiling of endothelial lineage markers (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), SNAI2 and TWIST1 transcription factors, mesenchymal specification markers (FAP, S100A4, ACTA2) and markers of extracellular matrix synthesis (COL1A1, COL1A2) along with the subsequent negative staining for CD31/PECAM1, VE-cadherin, or ERG and positive staining for intracellular type I collagen.Aim. To  develop  an  algorithm  and  tools  to  determine  endothelial-to-mesenchymal transition (EndoMT) in vitro.Methods. We examined two batches of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) where the first cell batch had a conventional endothelial morphology and the second cell batch underwent a spontaneous EndoMT. Human coronary artery endothelial cells (HCAEC) and human internal thoracic artery endothelial cells (HITAEC) were used as the negative control for EndoMT. Molecular profile was assessed by means of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, Western blotting, and immunofluorescence staining with the further confocal microscopy.Results. In contrast to HUVEC with the physiological profile and arterial ECs, HUVEC undergoing EndoMT lost the expression of endothelial lineage markers (PECAM1, CDH5, VWF, ERG) and acquired the expression of EndoMT transcription factors (SNAI2, TWIST1), mesenchymal markers (FAP, S100A4, ACTA2), and extracellular matrix components (COL1A1, COL1A2) while retaining expression of the common vascular  markers  (HES1,  NRP1).  Western  blotting  analysis  confirmed  the loss of endothelial markers (CD31/PECAM1, VE-cadherin/CDH5, ERG) and demonstrated retained expression of abovementioned vascular markers. Negligible expression of MYH11 and SMTN genes encoding specific contractile markers (smooth muscle myosin heavy chain and smoothelin) in combination with the acquired expression of ACTA2 gene encoding less specific contractile marker alpha smooth muscle actin indicated the phenotypic identity of EndoMT-transformed HUVEC to myofibroblasts but not contractile vascular smooth muscle cells. Loss of immunofluorescence staining of endothelial markers (CD31/PECAM-1, VE-cadherin, and ERG transcription factor) and pronounced intracellular staining of type I collagen testified to the ongoing EndoMT.Conclusion. An  algorithm  to  assess  EndoMT  implies  measurement  of  the  expression  of PECAM1, CDH5, VWF, ERG, SNAI2, TWIST1, FAP, S100A4, ACTA2, COL1A1, and COL1A2 genes in combination with the respective immunofluorescence staining for CD31/PECAM-1, VE-cadherin, or ERG transcription factor and type I collagen.Основные положения. Спонтанный эндотелиально-мезенхимальный переход первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека характеризуется многократным повышением уровня экспрессии генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, полной потерей экспрессии маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки (CD31/PECAM1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG), ярко выраженной экспрессией генов маркеров мезенхимальной дифференцировки (фибробласт-специфичного белка и альфа-актина гладких мышц) и выраженным синтезом основного компонента внеклеточного матрикса коллагена I типа. Оптимальным алгоритмом определения эндотелиально-мезенхимального перехода является определение транскрипции генов эндотелиальной дифференцировки (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, генов мезенхимальной дифференцировки (FAP, S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) с последующей верификацией отрицательной экспрессии маркеров эндотелиального фенотипа и положительной экспрессии коллагена I типа внутри клеток посредством иммуно-флюоресцентного окрашивания.Цель. На основании случая спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода разработать алгоритм и предложить инструменты для его детекции in vitro.Материалы и методы. В эксперимент включены две серии первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC): первая серия – классический эндотелиальный морфотип, вторая – спонтанно подвергшиеся эндотелиально-мезенхимальному переходу. В качестве отрицательного контроля (клетки с эндотелиальным морфотипом) также использованы первичные эндотелиальные клетки коронарной артерии человека (HCAEC) и первичные эндотелиальные клетки внутренней грудной артерии человека (HITAEC). Оценку молекулярного профиля клеток проводили методами количественной полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции, иммуноблоттинга и иммунофлюоресцентного окрашивания с последующей конфокальной микроскопией.Результаты. В отличие от HUVEC с физиологическим профилем молекулярной экспрессии, а также артериальных эндотелиальных клеток HUVEC в состоянии эндотелиально-мезенхимального перехода характеризовались потерей экспрессии генов маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки  (PECAM1,  CDH5,  VWF,  ERG),  многократно  повышенной экспрессией генов двух транскрипционных факторов перехода (SNAI2, TWIST1), приобретением экспрессии генов маркеров клеток мезенхимального ряда (FAP, S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) при сохраненной экспрессии генов общесосудистых маркеров (HES1, NRP1). Отсутствие экспрессии генов специфичных сократительных маркеров (тяжелой цепи миозина гладких мышц (MYH11) и смузелина (SMTN)) в сочетании с приобретенной экспрессией гена менее специфичного сократительного маркера альфа-актина гладких мышц (ACTA2) свидетельствовало о фенотипической схожести трансформированных клеток с миофибробластами, а не c сосудистыми гладкомышечными клетками сократительного фенотипа. Анализ белковой экспрессии методом иммуноблоттинга подтвердил потерю экспрессии эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM1, VE-кадгерин/CDH5, ERG) и продемонстрировал сохранность экспрессии вышеуказанных общесосудистых маркеров. Отсутствие иммунофлюоресцентного свечения эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM-1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG) в сочетании с интенсивным внутриклеточным свечением основного синтезируемого белка межклеточного матрикса – коллагена I типа – также подтвердило реализацию транскрипционной программы эндотелиально-мезенхимального перехода.Заключение. Алгоритм оценки эндотелиально-мезенхимального перехода подразумевает измерение экспрессии генов PECAM1, CDH5, VWF, ERG, SNAI2, TWIST1, FAP, S100A4, ACTA2, COL1A1 и COL1A2, комбинированное с иммунофлюоресцентным окрашиванием на CD31/PECAM-1, VE-кадгерин и транскрипционный фактор ERG в сочетании с окрашиванием на коллаген I типа

PERSPECTIVES THE USE OF CYTOKINESIS-BLOCKED MICRONUCLEUS ASSAY TO ASSESS THE GENOTOXIC EFFECTS OF RADON ON THE HUMAN BODY

We evaluated the extent DNA damage in people living in high radon concentrations. These people have been increasing special markers — micronuclei — in lymphocytes