Актуальные направления применения клеточной терапии в регенеративной медицине

Cell therapy is a key tool of regenerative medicine, but until the beginning of the last decade, products based on viable human cells were used primarily to repair damaged tissues and organs. Currently, the field of application of biomedical cell products has expanded significantly, but researchers still show considerable interest in the use of human cells in regenerative medicine. The stage of development of cell products varies significantly depending on the type of tissue and pathology, and ranges from preclinical and pilot clinical trials to authorised drugs with a long history of use. On the one hand, this may be attributed to methodological differences in the production and use of cell products, and on the other, to specific aspects of differentiation of cell types used in regenerative medicine, primarily mesenchymal stem cells. The aim of this study was to analyse current trends in the use of cell therapy in regenerative medicine and prospects for using available technologies. The paper summarises the main achievements in the use of cell therapy for regeneration of skin, bone and cartilage, nervous and cardiovascular systems. The key mechanisms of cell therapy effect are determined, on the one hand, by the differentiation potential of multipotent cells, and on the other, by the complex (immunomodulating, angiogenic, proliferative) action of the proteome expressed by the administered cells. The paper describes viable cell-based products currently authorised for each indication, and analyses the level of their clinical use. It might be promising to use directed cell differentiation technologies, as well as induced pluripotent cells in regenerative medicine.Клеточная терапия является ключевым инструментом регенеративной медицины, и вплоть до 2010 года продукты на основе жизнеспособных клеток человека применялись преимущественно для восстановления поврежденных тканей и органов. В настоящее время сфера применения биомедицинских клеточных продуктов значительно расширилась, однако интерес исследователей к использованию клеток в регенеративной медицине остается стабильно высоким. В зависимости от типа ткани и патологии уровень разработки клеточных продуктов значительно отличается: от доклинических и пилотных клинических исследований до зарегистрированных препаратов с многолетним опытом применения. Данный факт, с одной стороны, может быть связан с методологическими особенностями производства и применения клеточных продуктов, с другой — с особенностями дифференцировки типов клеток, используемых в регенеративной медицине, прежде всего мезенхимальных стволовых клеток. Цель работы — анализ современных направлений использования клеточной терапии в регенеративной медицине и перспектив применения существующих технологий. Представлены основные достижения использования клеточной терапии в регенерации кожи, костно-хрящевого аппарата, нервной и сердечно-сосудистой систем. Ключевые механизмы лечебного действия клеточной терапии обусловлены, с одной стороны, потенциалом мультипотентных клеток к дифференцировке, с другой — комплексным (иммуномодулирующим, ангиогенным, пролиферативным) действием экспрессируемого протеома вводимых клеток. Для каждого из показаний описаны зарегистрированные в настоящее время продукты на основе жизнеспособных клеток человека и проанализирован их уровень применения в клинической практике. Перспективным представляется использование в регенеративной медицине разработанных технологий направленной дифференцировки, а также применение индуцированных плюрипотентных клеток.

Применение метода коротких тандемных повторов для аутентификации клеточных линий

Short tandem repeat analysis (STR) is a well-established international method of authentication and genetic stability testing of cell lines (CLs). Therefore, the development and introduction of this method into routine practice of cell banks and cell culture collections is a pressing concern. In addition, the expansion of the field of cell-line based biomedical cell products (BСPs) necessitates the implementation of STR as a tool of identification testing during quality control. The State Pharmacopoeia of the Russian Federation does not require mandatory use of STR for cell line identification, while other countries have been using this method for cell line quality control for about a decade. The use of identified CLs in medical practice will ensure the efficacy and safety of BCPs. The aim of the study was to assess the possibility of using STR analysis for authentication and genetic stability testing of CLs using U937, WISH, WIL2-S, NK-92, and Jurkat Clone E6-1 CLs as examples. Materials and me­thods: the following human CLs were used in the study: U937 (ECACC), WISH (ATCC), WIL2S (ATCC), NK-92 (ATCC), and Jurkat Clone E6-1 (ATCC). The CL allelic profiles were determined by STR using the COrDIS Plus kit (Gordiz, Russia). The electrophoretic separation was performed using a Genetic Analyzer 3500 Series instrument. The data provided on the websites of the European Collection of Authenticated Cell Cultures and American Type Culture Collection were used to compare the CL profiles. Results: the AuthentiFiler PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) and the GenePrint 10 System (Promega Corporation, USA) intended for CL authentication by STR were compared with the characteristics of the COrDIS plus kit (Gordiz, Russia). The results of the comparison demonstrated that the COrDIS plus kit includes all the loci found in the foreign kits, as well as the loci recommended by the International Cell Line Authentication Committee. The U-937, WIL2S, and NK-92 CLs demonstrated genetic identity with the reference profiles available on the websites of the international collections. The Jurkat Clone E6-1 CL was found to be genetically instable due to the loss of the amelogenin gene. Conclusions: it was demonstrated by the examples of U937, WISH, WIL2-S, NK-92, and Jurkat Clone E6-1 CLs that STR and the COrDIS plus kit could be used for authentication and genetic stability testing. The obtained results suggest the feasibility of using the COrDIS plus kit for the analysis of CLs used in BCPs, for BCP quality control, and biomedical research.На сегодняшний день метод коротких тандемных повторов (STR-анализ) является признанным международным стандартом для установления подлинности и генетической стабильности клеточных линий, поэтому развитие и внедрение метода в рутинную практику банков/коллекций является актуальной задачей. Кроме того, развитие сферы биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), в которых клеточные линии являются основным компонентом, диктует необходимость внедрения метода STR-анализа и для оценки их подлинности в ходе экспертизы качества. В настоящее время Государственная фармакопея Российской Федерации не предусматривает обязательного применения метода STR-анализа для идентификации клеточных линий, в то время как в зарубежной практике для контроля качества клеточных линий он используется около десяти лет. Использование в медицинской практике идентифицированных клеточных линий обеспечит эффективность и безопасность применения БМКП. Цель работы: оценка возможности применения метода STR-анализа для аутентификации и определения генетической стабильности клеточных линий человека на примере U937, WISH, WIL2-S, NK-92, Jurkat Clone E6-1. Материалы и методы: клеточные линии человека — U937 (European Collection of Authenticated Cell Cultures, Европейский союз), WISH, WIL2-S, NK-92, Jurkat Clone E6-1 (American Type Culture Collection, США). Определение аллельного профиля клеточных линий осуществляли методом STR-анализа с использованием набора COrDIS Plus (Gordiz, Россия). Электрофоретическое разделение проводили на приборе Genetic Analyzer 3500 Series. Сравнение профилей клеточных линий проводили с использованием данных, представленных на сайтах коллекций European Collection of Authenticated Cell Cultures, American Type Culture Collection. Результаты: на основе сравнительных данных о наборах AuthentiFiler™ PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific, США) и GenePrint® 10 System (Promega Corporation, США), предназначенных для определения подлинности клеточных линий методом STR-анализа, с характеристиками набора COrDIS plus установлено, что набор COrDIS plus содержит в себе все локусы суммарно из зарубежных наборов, а также включает локусы, рекомендованные Международным комитетом по идентификации клеточных линий человека. Установлено полное генетическое соответствие линий U-937, WIL2S, WISH, NK-92 стандартным профилям, представленным на сайтах международных коллекций. Выявлена генетическая нестабильность клеточной линии Jurkat Clone E6-1, проявляющаяся потерей гена амелогенина. Выводы: подтверждена возможность применения метода STR-анализа для аутентификации и определения генетической стабильности с использованием набора COrDIS plus на примере клеточных линий U937, WISH, WIL2-S, NK-92, Jurkat Clone E6-1. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности применения набора COrDIS plus для анализа клеточных линий, входящих в состав БМКП, в биомедицинских исследованиях, а также в ходе проведения экспертизы качества БМКП

Обоснование методических подходов к экспертной оценке подлинности биомедицинских клеточных продуктов

The manufacturer (developer) has to prepare a specification for each newly developed biomedical cell product (BCP) that has passed the stage of preclinical studies. The specification is included into the registration dossier when applying for marketing authorisation of a BCP. In accordance with the Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 14n of 19 January 2017 «On approval of the specification format for a biomedical cell product» the specification should contain information about authenticity of the cell line used in the BCP, namely: morphological characteristics, expression of specific markers, expression of specific genes, expression of specific proteins, as well as markers of cell line stability. At present Russia has no practical experience in BCP quality evaluation. The aim of the study was to substantiate methodological approaches to authentication of cell lines used in BCPs as illustrated by quality evaluation of the DF-2 model cell line using test methods that allow for characterisation of the morphological, genetic, immunophenotypic, and cytogenetic profile of the cell line. Materials and methods: the study analysed the DF-2 cell line — human dermal fibroblasts (mesenchymal stem cells) obtained from the Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences (St. Petersburg). The following analytical test methods were used in the study: morphological analysis; flow cytometry for immunophenotyping of the DF-2 model cell line; short tandem repeats for creating an allelic profile of the model cell line; cytogenetic analysis — differential DAPI staining of metaphase chromosomes. Results: the paper summarises methodological approaches to identification testing of medicines containing living human cells (BCP analogues) currently used in international practice, and presents the results of authentication of the model cell line. Conclusions: methods used for BCP identification testing should ensure unambiguous authentication of the cell line according to its specification. The study performed helped to work out the procedure of authentication of a model cell line.На каждый разработанный биомедицинский клеточный продукт (БМКП), прошедший доклинические исследования, производитель (разработчик) составляет спецификацию, которая входит в состав регистрационного досье при подаче заявления на государственную регистрацию БМКП. В соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 января 2017 г. № 14н «Об утверждении формы спецификации на биомедицинский клеточный продукт» спецификация должна содержать сведения об идентичности (подлинности) клеточной линии, входящей в состав БМКП, которая включает: морфологические характеристики, экспрессию специфических маркеров, экспрессию специфических генов, экспрессию специфических белков, а также маркеры стабильности клеточной линии. В Российской Федерации на сегодняшний день отсутствует практический опыт проведения экспертизы качества БМКП. Цель работы: обоснование методических подходов к определению идентичности (подлинности) клеточных линий, входящих в состав БМКП, в рамках экспертизы качества на модельной клеточной линии DF-2 при использовании методов, позволяющих характеризовать морфологический, генетический, иммунофенотипический и цитогенетический профиль клеточной линии. Материалы и методы: объектом исследования была клеточная линия DF-2 — дермальные фибробласты человека (мезенхимные стволовые клетки) — получена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). В работе использовали следующие методы анализа: морфологический анализ; метод проточной цитометрии для иммунофенотипирования модельной клеточной линии DF-2; метод коротких тандемных повторов для построения аллельного профиля модельной клеточной линии; цитогенетическое исследование — DAPI-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом. Результаты: в статье представлены методические подходы к определению подлинности препаратов, содержащих жизнеспособные клетки человека (аналогов БМКП), используемые в мировой практике, а также представлены результаты экспериментального определения показателя «Идентичность (подлинность)» на модельной клеточной линии. Выводы: методы оценки подлинности БМКП должны гарантировать однозначную идентификацию клеточной линии в соответствии с представленной спецификацией. В результате проведенных исследований отработана процедура экспертной оценки идентичности (подлинности) модельной клеточной линии

Возможности прогнозирования интерстициального заболевания легких у больных системной склеродермией: результаты наблюдательного исследования

In patients with systemic sclerosis (SSc), interstitial lung disease (ILD) is a factor in the decline of functional capacity up to disability and is also the leading cause of death. Therefore, one of the most important tasks in the treatment of this group of patients is not only to detect involvement of respiratory system, but also to predict the likelihood of its development.Objective: to study the possibility of predicting the development of ILD and advanced ILD in patients with SSc.Material and methods. The study included 79 patients with SSc (mean age 64.4±11.5 years; 94.9% women) from the Registry of myositis, SSc and Mixed Connective Tissue Diseases (РЕМИССиС) who underwent high-resolution computed tomography (HRCT) of the lungs. Classification trees (CTr) were constructed to predict the development of widespread ILD using the CHAID algorithm (exhaustive). All patients were tested for antibodies against Scl-70 (anti-Scl-70), CENP-B (anti-CENP-B), and PmScl (anti-PmScl).Results and discussion. ILD signs according to HRCT were detected in 53 patients. Fibrotic (34.2%) and cellular (15.2%) types of nonspecific interstitial pneumonia were the most common, and common interstitial pneumonia was less frequent (11.4%).The presence of ILD and advanced ILD (involvement of more than 20% of the lung parenchyma) were significantly associated with the detection of any autoantibodies, except anti-centromere antibodies, an increase in pulmonary artery systolic pressure, a decrease in forced vital capacity, diffusing capacity of the lungs, blood oxygen saturation at rest, and all parameters of six-minute walk test (6MWT), and complaints of shortness of breath. In addition, the presence of extensive ILD was also significantly associated with diffuse SSc and with SSc without skin manifestations.In establishing the CTr, it was found that the development of widespread ILD was unlikely in individuals who were able to walk more than 440 m in 6MWT and had neither anti-Scl-70 nor anti-PmScl.Significant associations were also found between the radiological pattern of ILD and the types of disease-specific antibodies.Conclusion. The 6MWT data in conjunction with the results of testing for SSc-specific autoantibodies provide a very accurate prediction of the presence and extent of ILD. It is advisable to include these indicators in the algorithm for screening and monitoring patients with SSc.У пациентов с системной склеродермией (ССД) интерстициальное заболевание легких (ИЗЛ) является фактором снижения функциональной способности, вплоть до инвалидизации, а также основной причиной смерти. Поэтому одна из важнейших задач при ведении данной группы больных — не только выявление поражения дыхательной системы, но и прогнозирование вероятности его развития.Цель исследования — изучение возможности прогнозирования развития ИЗЛ и распространенного ИЗЛ у пациентов с ССД.Материал и методы. В исследование включено 79 больных ССД (средний возраст — 64,4±11,5 года; 94,9% — женщины) из Регистра миозитов, ССД и смешанного заболевания соединительной ткани (РЕМИССиС), которым была проведена компьютерная томография легких высокого разрешения (КТВР). Для прогнозирования развития распространенного ИЗЛ осуществлялось построение классификационных деревьев (КД) с помощью алгоритма CHAID (исчерпывающий). У всех пациентов проведено тестирование на антитела к Scl70 (анти-Scl70), CENP-B (анти-CENP-B), PmScl (анти-PmScl).Результаты и обсуждение. Признаки ИЗЛ по данным КТВР выявлены у 53 пациентов. Наиболее часто обнаруживались фибротический (34,2%) и клеточный (15,2%) типы неспецифической интерстициальной пневмонии, реже — обычная интерстициальная пневмония (11,4%). Наличие ИЗЛ и распространенного ИЗЛ (вовлечение более 20% паренхимы легких) значимо ассоциировалось с выявлением любых аутоантител, кроме антицентромерных, повышением систолического давления в легочной артерии, снижением форсированной жизненной емкости легких, диффузионной способности легких, насыщения крови кислородом в покое и всех показателей теста 6-минутной ходьбы (ТШХ), а также с жалобами на одышку. Кроме того, наличие распространенного ИЗЛ, также значимо было связано с диффузной формой ССД и с ССД без кожных проявлений.При построении КД установлено, что развитие распространенного ИЗЛ маловероятно у лиц, способных пройти более 440 м в ТШХ и не имеющих ни анти-Scl70, ни анти-PmScl.Обнаружены также значимые связи между рентгенологическим паттерном ИЗЛ и типами выявленных болезнь-специфических антител.Заключение. Данные ТШХ в сочетании с результатами исследования на специфические для ССД аутоантитела позволяют с высокой точностью прогнозировать наличие и распространенность ИЗЛ. Эти показатели целесообразно включить в алгоритм обследования и наблюдения пациентов с ССД

The Use of Short Tandem Repeat Analysis for Cell Line Authentication

Short tandem repeat analysis (STR) is a well-established international method of authentication and genetic stability testing of cell lines (CLs). Therefore, the development and introduction of this method into routine practice of cell banks and cell culture collections is a pressing concern. In addition, the expansion of the field of cell-line based biomedical cell products (BСPs) necessitates the implementation of STR as a tool of identification testing during quality control. The State Pharmacopoeia of the Russian Federation does not require mandatory use of STR for cell line identification, while other countries have been using this method for cell line quality control for about a decade. The use of identified CLs in medical practice will ensure the efficacy and safety of BCPs. The aim of the study was to assess the possibility of using STR analysis for authentication and genetic stability testing of CLs using U937, WISH, WIL2-S, NK-92, and Jurkat Clone E6-1 CLs as examples. Materials and me­thods: the following human CLs were used in the study: U937 (ECACC), WISH (ATCC), WIL2S (ATCC), NK-92 (ATCC), and Jurkat Clone E6-1 (ATCC). The CL allelic profiles were determined by STR using the COrDIS Plus kit (Gordiz, Russia). The electrophoretic separation was performed using a Genetic Analyzer 3500 Series instrument. The data provided on the websites of the European Collection of Authenticated Cell Cultures and American Type Culture Collection were used to compare the CL profiles. Results: the AuthentiFiler PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) and the GenePrint 10 System (Promega Corporation, USA) intended for CL authentication by STR were compared with the characteristics of the COrDIS plus kit (Gordiz, Russia). The results of the comparison demonstrated that the COrDIS plus kit includes all the loci found in the foreign kits, as well as the loci recommended by the International Cell Line Authentication Committee. The U-937, WIL2S, and NK-92 CLs demonstrated genetic identity with the reference profiles available on the websites of the international collections. The Jurkat Clone E6-1 CL was found to be genetically instable due to the loss of the amelogenin gene. Conclusions: it was demonstrated by the examples of U937, WISH, WIL2-S, NK-92, and Jurkat Clone E6-1 CLs that STR and the COrDIS plus kit could be used for authentication and genetic stability testing. The obtained results suggest the feasibility of using the COrDIS plus kit for the analysis of CLs used in BCPs, for BCP quality control, and biomedical research

Current Trends in the Use of Cell Therapy in Regenerative Medicine

Cell therapy is a key tool of regenerative medicine, but until the beginning of the last decade, products based on viable human cells were used primarily to repair damaged tissues and organs. Currently, the field of application of biomedical cell products has expanded significantly, but researchers still show considerable interest in the use of human cells in regenerative medicine. The stage of development of cell products varies significantly depending on the type of tissue and pathology, and ranges from preclinical and pilot clinical trials to authorised drugs with a long history of use. On the one hand, this may be attributed to methodological differences in the production and use of cell products, and on the other, to specific aspects of differentiation of cell types used in regenerative medicine, primarily mesenchymal stem cells. The aim of this study was to analyse current trends in the use of cell therapy in regenerative medicine and prospects for using available technologies. The paper summarises the main achievements in the use of cell therapy for regeneration of skin, bone and cartilage, nervous and cardiovascular systems. The key mechanisms of cell therapy effect are determined, on the one hand, by the differentiation potential of multipotent cells, and on the other, by the complex (immunomodulating, angiogenic, proliferative) action of the proteome expressed by the administered cells. The paper describes viable cell-based products currently authorised for each indication, and analyses the level of their clinical use. It might be promising to use directed cell differentiation technologies, as well as induced pluripotent cells in regenerative medicine

Justification of Methodological Approaches to Identification Testing of Biomedical Cell Products

The manufacturer (developer) has to prepare a specification for each newly developed biomedical cell product (BCP) that has passed the stage of preclinical studies. The specification is included into the registration dossier when applying for marketing authorisation of a BCP. In accordance with the Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 14n of 19 January 2017 «On approval of the specification format for a biomedical cell product» the specification should contain information about authenticity of the cell line used in the BCP, namely: morphological characteristics, expression of specific markers, expression of specific genes, expression of specific proteins, as well as markers of cell line stability. At present Russia has no practical experience in BCP quality evaluation. The aim of the study was to substantiate methodological approaches to authentication of cell lines used in BCPs as illustrated by quality evaluation of the DF-2 model cell line using test methods that allow for characterisation of the morphological, genetic, immunophenotypic, and cytogenetic profile of the cell line. Materials and methods: the study analysed the DF-2 cell line — human dermal fibroblasts (mesenchymal stem cells) obtained from the Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences (St. Petersburg). The following analytical test methods were used in the study: morphological analysis; flow cytometry for immunophenotyping of the DF-2 model cell line; short tandem repeats for creating an allelic profile of the model cell line; cytogenetic analysis — differential DAPI staining of metaphase chromosomes. Results: the paper summarises methodological approaches to identification testing of medicines containing living human cells (BCP analogues) currently used in international practice, and presents the results of authentication of the model cell line. Conclusions: methods used for BCP identification testing should ensure unambiguous authentication of the cell line according to its specification. The study performed helped to work out the procedure of authentication of a model cell line