Получение и характеристика гомодимерной формы RBD S-белка SARS-CoV-2, обладающей повышенной авидностью к специфическим антителам

Monitoring of the proportion of immune individuals and the effectiveness of vaccination in a population involves evaluation of several important parameters, including the level of virus-neutralising antibodies. In order to combat the COVID-19 pandemic, it is essential to develop approaches to detecting SARS-CoV-2 neutralising antibodies by safe, simple and rapid methods that do not require live viruses. To develop a test system for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that detects potential neutralising antibodies, it is necessary to obtain a highly purified recombinant receptor-binding domain (RBD) of the spike (S) protein with high avidity for specific antibodies.The aim of the study was to obtain and characterise a SARS-CoV-2 S-protein RBD homodimer and a recombinant RBD-expressing cell line, as well as to create an ELISA system for detecting potential neutralising antibodies.Materials and methods: the genetic construct was designed in silico. To generate a stable producer cell line, the authors transfected CHO-S cells, subjected them to antibiotic pressure, and selected the optimal clone. To isolate monomeric and homodimeric RBD forms, the authors purified the recombinant RBD by chromatographic methods. Further, they analysed the activity of the RBD forms by Western blotting, bio-layer interferometry, and indirect ELISA. The analysis involved mono clonal antibodies GamXRH19, GamP2C5, and h6g3, as well as serum samples from volunteers vaccinated with Gam-COVID-Vac (Sputnik V) and unvaccinated ones.Results: the authors produced the CHO-S cell line for stable expression of the recombinant SARS-CoV-2 S-protein RBD. The study demonstrated the recombinant RBD’s ability to homodimerise after fed-batch cultivation of the cell line for more than 7 days due to the presence of unpaired cysteines. The purified recombinant RBD yield from culture broth was 30–50 mg/L. Monomeric and homodimeric RBD forms were separated using gel-filtration chromatography and characterised by their ability to interact with specific monoclonal antibodies, as well as with serum samples from vaccinated volunteers. The homodimeric recombinant RBD showed increased avidity for both monoclonal and immune sera antibodies.Conclusions: the homodimeric recombinant RBD may be more preferable for the analysis of levels of antibodies to the receptor-binding domain of the SARS-CoV-2 S protein.Важным параметром, оцениваемым при мониторинге иммунной прослойки у населения и эффективности вакцинации населения, является уровень вируснейтрализующих антител. Разработка подхода к выявлению вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 с помощью безопасного, простого и быстрого метода, не требующего использования живых вирусов, имеет большое значение для борьбы с пандемией COVID-19. Для разработки тест-систем для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), детектирующих потенциально вируснейтрализующие антитела, необходимо получение высокоочищенного рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка, обладающего высокой авидностью к специфическим антителам.Цель работы: получение и характеристика гомодимерной формы RBD S-белка вируса SARS-CoV-2, а также клеточной линии, продуцирующей рекомбинантный RBD, для создания ИФА тест-системы для выявления потенциально вируснейтрализующих антител.Материалы и методы: дизайн генетической конструкции проводили in silico. Стабильную клеточную линию получали при помощи трансфекции клеток CHO-S, селекции на антибиотике и отбора оптимального клона. Рекомбинантный RBD очищали с использованием хроматографических методов, получали мономерную и гомодимерную формы RBD. Активность полученных форм анализировали с использованием методов Вестерн-блот, биослойной интерферометрии и непрямго ИФА. Для анализа использовали моноклональные антитела GamXRH19, GamP2C5 и h6g3, а также образцы сывороток крови добровольцев, вакцинированных препаратом Гам-КОВИД-Вак, и невакцинированных добровольцев.Результаты: получена клеточная линия CHO-S, стабильно продуцирующая рекомбинантный RBD S-белка вируса SARS-CoV-2. Показано, что при культивировании данной клеточной линии в режиме fed-batch более 7 суток рекомбинантный RBD способен образовывать гомодимеры за счет наличия неспаренных цистеинов. Количественный выход очищенного рекомбинантного RBD из культуральной жидкости составил 30–50 мг/л. Мономерная и гомодимерная формы RBD были разделены при помощи гель-фильтрации и охарактеризованы по способности взаимодействовать со специфическими моноклональными антителами, а также сыворотками крови от вакцинированных добровольцев. Продемонстрировано, что именно гомодимерная форма рекомбинантного RBD обладает повышенной авидностью к моноклональным антителам и антителам в сыворотке крови вакцинированных.Выводы: гомодимерная форма рекомбинантного RBD может являться более предпочтительной для анализа уровня антител к рецептор-связывающему домену S-белка вируса SARS-CoV-2

Современные нормативные требования к проведению доклинических исследований профилактических вакцин

Vaccines are subject to specific regulatory requirements for the evaluation of their quality, safety, and efficacy. In 2005, the World Health Organisation (WHO), as the main international organisation coordinating measures to combat infectious disease outbreaks, began developing documents on the evaluation of vaccine quality, safety, and efficacy. The world’s leading regulatory authorities (FDA, EMA, etc.) have also issued recommendations for conducting non-clinical studies of vaccines.The aim of this study was a critical review of the regulatory requirements established by foreign national and international regulatory authorities for non-clinical evaluation of the safety and efficacy of vaccines.According to the study results, since the 2000s, the WHO and the world’s leading regulatory authorities have produced more than 40 regulatory documents describing certain aspects of non-clinical studies of the safety and efficacy of vaccines. These documents can be divided into two groups: the first group addresses non-clinical studies of vaccines in general, and the second one dwells upon the evaluation of the quality, safety, and efficacy of specific types of vaccines. For the Russian guidelines on non-clinical evaluation of the quality, safety, and efficacy of immunobiologicals, the latest revision dates back to 2013 and does not provide any information on new medicinal products. Currently, work is underway to prepare the regulatory framework for medicines, including vaccines, in the Member States of the Eurasian Economic Union (EAEU). This review of regulatory documents on non-clinical safety and efficacy studies of vaccines may be useful in drafting harmonised guidelines for the relevant groups of vaccines in the EAEU. It may also be of use to developers, manufacturers, and researchers involved in the creation and non-clinical study of vaccines.К вакцинам предъявляются особые нормативные требования для оценки их качества, эффективности и безопасности. Учитывая, что Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) является основной международной организацией, координирующей проведение мероприятий по борьбе с вспышками инфекционных заболеваний, начиная с 2005 г. ВОЗ начала разработку документов, касающихся вопросов оценки качества, безопасности и эффективности вакцин. Ведущими мировыми регуляторными органами (FDA, ЕМА и др.) подготовлены рекомендации для проведения доклинических исследований вакцин.Цель работы — критический анализ нормативных требований для доклинической оценки эффективности и безопасности вакцин, подготовленных зарубежными национальными и международными регуляторными органами.Проведенный анализ показал, что начиная с 2000-х гг. ВОЗ и ведущими регуляторными органами мира было подготовлено более 40 нормативных документов, в которых описаны те или иные стороны проведения доклинических исследований эффективности и безопасности вакцин. Документы можно разделить на две группы: документы, посвященные общим вопросам доклинических исследований вакцин, и документы, касающиеся оценки качества, эффективности и безопасности определенных видов вакцин. В Российской Федерации последняя редакция рекомендаций для доклинической оценки качества, безопасности и эффективности иммунобиологических лекарственных препаратов была опубликована в 2013 г. и не содержит информации относительно препаратов последнего поколения. В настоящее время проводится работа по подготовке нормативно-правовой базы, касающейся лекарственных средств, в том числе вакцин, на территории государств — членов Евразийского экономического союза (ЕАЭС). Представленный в статье анализ нормативных документов по доклиническим исследованиям эффективности и безопасности вакцин может быть полезен для подготовки гармонизированных рекомендаций по соответствующим группам вакцин в рамках ЕАЭС, а также разработчикам, фармпроизводителям и ученым-исследователям, занимающимся созданием и доклиническими исследованиями вакцин

Оценка неопределенности результатов измерений при определении потери в массе при высушивании биологических лекарственных препаратов

Scientific relevance. GOST ISO/IEC 17025-2019 requires testing laboratories to evaluate the measurement uncertainty of their results. Estimating the uncertainty of analytical methods intended for biologicals is a challenging task that requires time, effort, and a special approach. Measurement uncertainty estimation is of particular interest in the case of measuring loss on drying (LOD) for biologicals, since LOD testing procedures involve analysing measurements of    a physical value, i.e. mass.Aim. This study aimed to estimate the measurement uncertainty of LOD determination in biological medicinal products.Materials and methods. The study examined a powdered active substance intended for a Bifidobacterium product (test sample). The authors conducted the LOD test in accordance with the State Pharmacopoeia of the Russian Federation (OFS.1.2.1.0010.15). Statistical processing of the results was performed using Microsoft Excel. To estimate the measurement uncertainty, the authors employed the bottom-up approach or used the standard deviation from testing results.Results. The authors identified the uncertainty components that affected the LOD determination results. When calculated using the bottom-up approach, the expanded uncertainty was 0.34% (coverage factor, k=2; approximate confidence level, 95%). In particular, the largest contributor to the expanded uncertainty was the uncertainty of measuring the mass of weighing bottles containing dried test samples (0.147%), whereas the smallest contributor was the uncertainty of weighing empty bottles (0.003%). When calculated using the standard deviation, the uncertainty of two parallel measurements amounted to 0.32%.Conclusions. Both approaches to calculating LOD measurement uncertainty yield comparable results. According to the uncertainty budget analysis, the uncertainty of measuring the mass of weighing bottles with dried test samples is the major  contributor to  the test result. For  this reason, the conditions of sample preparation should be carefully controlled. The study results confirm that the LOD measurement uncertainty can be calculated using the standard deviation. Testing laboratory teams may benefit from the methods for identifying the factors influencing LOD test results and the methods for calculating the uncertainty of measurement described in this study.Актуальность. Исследование неопределенности результатов измерений, проводимых испытательными лабораториями, предусмотрено ГОСТ ISO/IEC 17025-2019. Оценивание неопределенности методик испытаний биологических лекарственных препаратов представляет собой сложную задачу,  требующую особого подхода и  значительных  временных и трудовых ресурсов. Актуальной является оценка неопределенности измерений на примере методики определения потери в массе при высушивании биологических лекарственных препаратов, поскольку в процессе ее реализации анализируется именно результат измерения (взвешивания) физической величины — массы.Цель. Оценить неопределенность результатов измерений при  определении потери в  массе при высушивании биологических лекарственных препаратов.Материалы и методы. Субстанция-порошок для изготовления бифидосодержащего препарата (исследуемый образец). Испытание проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации ОФС.1.2.1.0010.15. Статистическую обработку результатов выполняли с использованием программы Microsoft Exсel. Расчет неопределенности проводили  двумя   способами:   при   помощи   подхода   «снизу   вверх» и с использованием доверительного интервала.Результаты. Идентифицированы составляющие неопределенности, влияющие  на  результат измерения потери в массе при высушивании. Расширенная неопределенность, рассчитанная с использованием подхода «снизу вверх»,  составила  0,34%  (коэффициент  охвата k=2, уровень доверия приблизительно 95%), при этом наибольший вклад вносит неопределенность измерения массы бюкса после высушивания образца — 0,147%; наименьший вклад — неопределенность измерения массы пустого бюкса — 0,003%. Неопределенность двух параллельных измерений, рассчитанная с помощью доверительного интервала, составила 0,32%.Выводы. Два подхода к расчету неопределенности результатов  измерений  потери  в  массе при высушивании дают сопоставимые результаты. Анализ бюджета неопределенности выявил, что наибольший вклад в результат испытания вносит неопределенность  измерения массы бюкса после высушивания образца, что требует тщательного контроля условий пробоподготовки. Для оценки неопределенности может  быть использован способ  расчета с помощью доверительного интервала. Методология анализа  методики  потери  в  массе при  высушивании с  точки зрения  выявления факторов, влияющих на  результат  испытания, и представленные способы расчета неопределенности могут быть полезны специалистам испытательных лабораторий

Актуальные направления и риски применения препаратов на основе технологий редактирования генома

Scientific relevance. To date, multiple approaches to genome editing have been developed based on different genome-editing systems (GESs) and genome modifications that result in single- or double-strand DNA breaks, either in vivo or ex vivo, followed by homologous recombination or non-homologous end joining to restore the sequence. However, the use of GESs is associated with a number of potential risks arising from the complex biology of such medicinal products and the fundamental role of their target, i.e. the DNA molecule.Aim. This study analysed the most relevant trends and risks associated with medicinal products based on genome editing, the ways taken to overcome these risks, and the research methods used to identify and control the development of undesirable effects.According to the literature, the adverse effects of GESs may arise both from the methods used to deliver GES components into the cell and from the functional activity of the GES itself, which includes insufficient on-target or undesirable off-target effects. This review indicates the main risks associated with the use of GESs. Preferable strategies to mitigate the risks of using GESs include repairing DNA breaks by homologous recombination, selecting GESs and related endonucleases that have greater specificity and restriction accuracy, increasing guide RNA specificity (for CRISPR/Cas), correcting the activity of the system regulating the cell cycle and apoptosis in a controlled manner, regulating the duration of expression and persistence of GES components in cells, etc.Conclusions. The requirement to include quality, efficacy, and safety data when submitting registration dossiers for advanced therapy medicinal products prompts the discussion of the main risks associated with such products.Актуальность. В настоящее время разработано множество различных подходов к редактированию генома, основанных на применении разных систем редактирования, осуществлении модификаций генома с образованием одноцепочечных или двухцепочечных разрывов ДНК, in vivo или ex vivo, с восстановлением последовательности генома с помощью гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов ДНК. Однако применение систем редактирования генома сопряжено с возможным возникновением целого ряда рисков, вследствие сложной биологии таких препаратов и фундаментального значения цели их воздействия – молекулы ДНК.Цель. Анализ актуальных направлений и рисков, связанных с применением препаратов на основе систем редактирования генома, способов снижения рисков и методов их исследования, используемых для выявления и контроля возникновения нежелательных эффектов.Обсуждение. Анализ данных литературы показал, что нежелательные эффекты от применения препаратов на основе систем редактирования генома могут быть связаны как со способами доставки компонентов системы в клетку, так и с функциональной активностью самой системы (недостаточное целевое или нежелательное нецелевое действия). В обзоре обозначены основные риски при использовании систем редактирования генома. Установлено, что для снижения рисков применения систем редактирования генома предпочтительно проведение репарации разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации, использование обладающих большей специфичностью и точностью рестрикции систем редактирования генома и эндонуклеаз в их составе, увеличение специфичности гРНК (для CRISPR/Cas), контролируемая коррекция активности элементов системы регуляции клеточного цикла и апоптоза, регуляция продолжительности экспрессии и персистенции компонентов систем редактирования генома в клетках и др.Заключение. Освещение основных рисков, связанных с применением этой группы препаратов, является актуальным в связи с необходимостью предоставления данных в регистрационном досье на высокотехнологичный лекарственный препарат, касающихся оценки качества, эффективности и безопасности

Лекарственные препараты пыльцевых аллергенов: современные аспекты стандартизации

Scientific relevance. Pollen allergen medicines are in high demand, and their therapeutic benefits directly correlate with their standardisation. Better diagnosis and treatment of allergic diseases require state-of-the-art procedures for assessing the allergenic activity of pollen allergen products using reference standards and physicochemical testing methods.Aim. The study aimed at developing methodological approaches to the standardisation of pollen allergen products in order to shift to measuring their potency in allergenic activity units (AAU) and bring their quality in line with the requirements of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation.Materials and methods. The study used pollen allergen reference standards by Microgen, the WHO International Standard for timothy grass (Phleum pratense) pollen extract, a gel filtration standard kit of molecular weight markers ranging from 1.35 to 670 kDa, bovine serum albumin, serum samples with specific IgE obtained from donors sensitised to the study pollen allergens, labelled anti-human IgE antibodies, and reference standards for determining residual volatile solvents by gas chromatography. The identification of in-house reference standards for the potency of pollen allergens involved Western blotting (for allergenic components). The total protein content was determined by Bradford’s assay. In addition, the authors used high-performance liquid chromatography to study protein fractions and gas–liquid chromatography to determine the content of residual organic solvents.Results. To substitute the existing method of non-specific characterisation of allergenic activity in protein nitrogen units (PNU), the authors developed and tested a new method to control allergenic activity in allergenic activity units (AAU) based on an in vitro competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) procedure developed and validated in this study. Furthermore, the authors developed and certified 15 primary in-house reference standards with allergenic activity established in AAU/mL using skin tests in vivo. The experimental data were analysed to  standardise  the  allergenic  activity  of  the  pollen  allergens  manufactured by Microgen. The authors developed physicochemical methods for the certification of in-house reference standards and validated these methods in accordance with the State Pharmacopoeia of the Russian Federation. The study involved selecting chromatographic separation  conditions for residual organic solvents (acetone and diethyl ether) and establishing system suitability criteria for the chromatographic system. The allergenic activity of secondary in-house reference standards was certified against that of primary in-house reference standards using competitive ELISA. Thus, the authors managed to shift to the standardisation of pollen allergen products in vitro.Conclusions. The authors developed their competitive ELISA-based method to standardise pollen allergen products by comparing the inhibition of immune responses to a product and       a standard. The study demonstrated the feasibility of substituting allergenic activity quantification (in AAU) for protein nitrogen content determination (in PNU) and showed the first example of using AAU for the certification of in-house reference standards. Additionally, the authors developed and validated an analytical procedure for determining the content of residual organic solvents in pollen allergen products by gas–liquid chromatography.Актуальность. Лекарственные препараты пыльцевых аллергенов являются наиболее востребованными. Терапевтическая польза от их применения зависит от стандартизации. Для повышения эффективности диагностики и лечения аллергических заболеваний необходимы современные методы оценки специфической (аллергенной) активности лекарственных препаратов пыльцевых аллергенов с применением стандартных образцов и методов физико-химического анализа.Цель. Разработка методологических подходов к стандартизации лекарственных препаратов пыльцевых аллергенов для перехода к нормированию специфической активности в единицах аллергенной активности (ЕАА) и приведения качества препаратов в соответствие с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации.Материалы и методы. Использовали стандартные  образцы  пыльцевых  аллергенов  (АО «НПО «Микроген»), стандарт ВОЗ аллергена из пыльцы тимофеевки посевной, набор стандартов для эксклюзионной хроматографии MW 1350–670000 Da, бычий сывороточный альбумин, специфические IgE-содержащие сыворотки крови от лиц, сенсибилизированных к исследуемому аллергену, меченые антитела к IgE человека, стандартные образцы летучих растворителей для газовой хроматографии. Подтверждение подлинности стандартного образца предприятия аллергенной активности аллергена (СОП ААА) проводили методом вестерн-блота (аллергенные компоненты), содержание общего белка определяли колориметрически (метод Бредфорда). Дополнительно для изучения белковых фракций применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Количество остаточных органических растворителей в препаратах аллергенов оценивали при помощи газожидкостной хроматографии.Результаты. Вместо существующей ранее неспецифической характеристики аллергенной активности в единицах белкового азота (Protein Nitrogen Unit, PNU) был разработан  и апробирован новый метод контроля специфической активности в ЕАА на основе конкурентного иммуноферментного анализа (кИФА). Разработана и валидирована методика контроля аллергенной активности in vitro на основе кИФА. Проведены разработка и аттестация 15 первичных СОП ААА с присвоением им аллергенной активности в  EAA/мл по результатам тестирования методом кожных проб in vivo. Выполнен анализ экспериментальных данных с целью установления норм аллергенной активности для номенклатуры пыльцевых аллергенов, выпускаемых АО «НПО «Микроген». Разработаны и валидированы в соответствии с Государственной фармакопеей Российской Федерации физико-химические методы аттестации СОП ААА. Определены условия хроматографического разделения остаточных органических растворителей (ацетона, диэтилового эфира) и параметры пригодности хроматографической системы. Проведена аттестация вторичных СОП ААА методом кИФА по показателю аллергенной активности относительно первичных СОП, что позволило перейти к стандартизации препаратов аллергенов методом in vitro.Выводы. Разработана методология  стандартизации препаратов  аллергенов  методом кИФА по степени ингибирования иммунологической реакции в сравнении со стандартным образцом. Обоснована целесообразность исключения  показателя  «Содержание  белкового азота» (в единицах белкового азота, PNU) и замены его на показатель «Аллергенная активность» (в ЕАА). Полученные СОП ААА впервые на предприятии были аттестованы в ЕАА. Разработана и валидирована аналитическая методика определения количественного содержания остаточных органических растворителей в препаратах аллергенов с помощью метода газожидкостной хроматографии

Сравнительный анализ показателей качества лекарственного препарата альбумина человека с измененным стабилизирующим составом

Scientific relevance. The national and international human albumin preparations registered in the Russian Federation mainly differ in their excipient compositions. While all the international preparations of human albumin contain a mixture of sodium caprylate and N-acetyl-DL-tryptophan, the Russian ones contain only sodium caprylate. However, albumin stabilisation with sodium caprylate at high concentrations affects the ligand-binding properties of albumin. For this reason, as well as to achieve storage stability not only at temperatures of 2 °C to 8 °C but also   at room temperature, most international manufacturers have reduced the sodium caprylate content in albumin preparations and added N-acetyl-DL-tryptophan. This demonstrates the relevance of studying the quality of a new Russian human albumin preparation with a modified stabilising composition, including both sodium caprylate and N-acetyl-DL-tryptophan.Aim. The study aimed at comparing several quality attributes of the human albumin preparation with a modified stabilising composition with those of imported human albumin preparations.Materials and methods. The human albumin preparation with a modified stabilising composition was manufactured by fractionation from donor plasma meeting the requirements of monograph FS.3.3.2.0001.19 of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation edition XIV. The quality control was in line with the monograph on human albumin (FS.3.3.2.0006.18), and statistical analysis was conducted in Microsoft Excel in accordance with the general chapter on statistical analysis (OFS.1.1.0013.15).Results. The study preparation complied with the requirements specified in monograph FS.3.3.2.0006.18. All the manufactured batches were clear, thermostable, sterile, and non-pyrogenic. The prekallikrein activator levels were low (below 1 IU/mL). The aluminium content varied from 30.36±10.39 µg/L to 50.22±6.94 µg/L. The study preparation contained sodium ions at a concentration from 127.44±10.46 mmol/L to 145.59±7.32 mmol/L and less than 0.01 mmol/g of potassium ions. The osmolarity exceeded 240 mOsm/L. The content of α- and β-globulins  ranged  from  1.79±0.06%  to  2.24±0.20%.  The  study  preparation  had  a  pH  level  of 6.9 to 7.2. The concentrations of polymers and aggregates did not exceed 0.5%.Conclusions. The quality attributes studied suggest that the human albumin preparation with   a modified stabilising composition is comparable to its international counterparts and that it meets Russian and European pharmacopoeial standards.Актуальность. Зарубежные лекарственные препараты альбумина человека, зарегистрированные в Российской Федерации, отличаются от отечественных главным образом по составу вспомогательных веществ. Все иностранные препараты альбумина содержат смесь вспомогательных веществ — натрия каприлата и N-ацетил-DL-триптофана; отечественные — только натрия каприлат. Однако стабилизация раствора альбумина натрия каприлатом в высоких концентрациях приводит к ухудшению его лигандсвязывающих свойств. По этой причине, а также для достижения стабильности препаратов при хранении не только при температуре от 2 до 8 °C, но и при комнатной температуре, большинство зарубежных производителей изменили состав препарата альбумина путем снижения содержания натрия каприлата и дополнительного введения N-ацетил-DL-триптофана. В связи с этим актуальным представляется изучение показателей качества разработанного отечественного препарата альбумина человека с измененным стабилизирующим составом, содержащим оба указанных компонента.Цель. Анализ показателей качества препарата альбумина человека с измененным стабилизирующим составом в сравнении с зарубежными лекарственными средствами.Материалы и методы. Активной фармацевтической субстанцией для получения препарата альбумина человека с измененным стабилизирующим составом служила плазма крови доноров, соответствующая требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV изд. (ГФ РФ XIV) ФС.3.3.2.0001.19. Препарат получали методом фракционирования белков плазмы крови. Контроль показателей качества препарата осуществляли в соответствии с требованиями  ФС.3.3.2.0006.18.  Статистическую обработку проводили с помощью программы Microsoft Excel в соответствии с ОФС.1.1.0013.15.Результаты. Показано соответствие показателей качества исследуемого препарата установленным требованиям  ФС.3.3.2.0006.18. В ходе исследований   установлено,  что изготовленные серии  препарата были прозрачными,  термостабильными, стерильными  и апирогенными; имели низкий уровень активатора прекалликреина — менее 1 МЕ/мл; содержание алюминия было в диапазоне от 30,36±10,39 до  50,22±6,94  мкг/л;  натрий-иона — от 127,44±10,46 до 145,59±7,32 ммоль/л; калий-иона — менее 0,01 ммоль/г; осмолярность — более 240 мОсм/л. Препарат содержал от 1,79±0,06 до 2,24±0,20% примесей других белков  (α- и β-глобулинов); показатель рН был в диапазоне от 6,9 до 7,2;  концентрация полимеров    и агрегатов не превышала 0,5%.Выводы. По изученным показателям качества препарат альбумина человека  с  измененным стабилизирующим составом был сопоставим с зарубежными аналогами и соответствовал требованиям ГФ РФ XIV и Европейской фармакопеи

Прогресс в разработке вакцин для профилактики лихорадки Чикунгунья и перспективы появления на рынке

Chikungunya fever is an acute infectious disease caused by the mosquito-borne Chikungunya virus (CHIKV). In the last decades, cases of the disease have been reported in more than 100 countries; therefore, CHIKV presents a global public health problem. CHIKV genotypes have limited antigenic diversity, and documented reinfection is very rare. Hence, a vaccine could prevent infection and potential disability, as well as reduce the epidemic spread of CHIKV in the population.The aim of the study was to review approaches to the development of preventive vaccines against CHIKV, evaluate promising vaccine candidates in preclinical or clinical development stages, and analyse perspectives and challenges of bringing these vaccines to the pharmaceutical market.According to the literature reviewed, both traditional and modern platforms are used in the development of CHIKV vaccines, which has been ongoing for several decades. Each platform has its advantages and limitations. The most popular platforms are live attenuated vaccines and vaccines with viral vector constructs. To date, about 25 vaccine candidates have successfully passed through preclinical studies, and more than 7 vaccine candidates have progressed to various phases of clinical studies. The preventive medicinal products that have reached the clinical development stage include 4 live attenuated vaccines, 1 inactivated vaccine, 1 vaccine containing virus-like particles, and 1 mRNA vaccine. All 7 candidates have demonstrated cross-protection against multiple genotypes of CHIKV at the level of either preclinical in vivo studies and/or clinical in vitro studies. The research continues, and this shows that not only the scientific community but also health systems are interested in bringing effective CHIKV vaccines to the pharmaceutical market.Лихорадка Чикунгунья представляет собой острое инфекционное заболевание, которое вызывается вирусом Чикунгунья (ЧИКВ) и распространяется комарами. В последние десятилетия эта инфекция зарегистрирована в более чем 100 странах и превратилась в глобальную проблему для здравоохранения. В связи с тем что антигенные различия между генотипами ЧИКВ незначительны и повторные случаи инфицирования практически не регистрируют, вакцина могла бы не только предотвратить заболевание и возможную потерю трудоспособности, но и уменьшить эпидемическое распространение ЧИКВ среди населения.Цель работы — анализ направлений разработки вакцинных препаратов для профилактики лихорадки Чикунгунья, оценка перспективных препаратов, вышедших на этапы доклинических (ДКИ) и клинических исследований (КИ), а также анализ перспектив и проблем вывода препаратов на фармацевтический рынок.Анализ научной литературы показал, что при разработке вакцин, продолжающейся уже несколько десятилетий, используются как традиционные, так и новейшие технологические платформы. Каждая технологическая платформа имеет свои недостатки и преимущества. На данном этапе около 25 разработок достаточно успешно прошли этап ДКИ и более 7 находятся на разных стадиях КИ. Самыми популярными являются платформа живых аттенуированных вакцин, а также платформа вакцин с использованием векторных конструкций. Препараты, находящиеся в разных фазах КИ, представлены живыми аттенуированными вакцинами (четыре препарата), инактивированным (один препарат), содержащим вирусоподобные частицы (один препарат) и созданным на основе мРНК (один препарат). Для всех семи вакцин была продемонстрирована перекрестная защита от штаммов ЧИКВ разных генотипов или на стадии ДКИ in vivo и/или на стадии КИ in vitro. Исследования продолжаются, что подтверждает наличие не только научного интереса, но также ожиданий системы здравоохранения к выводу на фармацевтический рынок эффективных вакцин против лихорадки Чикунгунья

Экспериментальная оценка возможности определения бактериальных эндотоксинов с помощью гель-тромб теста в вакцине брюшнотифозной Ви-полисахаридной

Scientific relevance. Currently, only the rabbit pyrogen test is used to test the Vianvac® typhoid Vi polysaccharide vaccine for pyrogenicity. As part of the product specification file, the gel-clot test for bacterial endotoxins (BE) will improve the reliability of quality control, as well as harmonise the requirements for the vaccine with the requirements outlined for this group of medicinal products by leading world pharmacopoeias.Aim. This study aimed at an experimental assessment of the applicability of the gel-clot test to the quantification of BE in the typhoid Vi polysaccharide vaccine.Materials and methods. This study used samples from 5 batches of the typhoid Vi polysaccharide vaccine (0.5 mL/dose, solution for subcutaneous injection), LAL and TAL reagents. The analysis included the gel-clot test and the pyrogenicity test according to the State Pharmacopoeia of the Russian Federation (OFS.1.2.4.0006.15 and OFS.1.2.4.0005.15, respectively).Results. According to calculations, the BE limit for the tested vaccine was 96 EU/mL, and the maximum valid dilution (MVD) was 3200. The authors determined the regulatory requirements for typhoid Vi polysaccharide vaccine quality in terms of BE (not more than 48 EU/dose). The in vitro BE tests were positive at vaccine dilutions of 1/16 to 1/32 and negative at 1/64 to 1/256. The authors selected and validated a working vaccine dilution of 1/128. The BE content measured in the tested samples ranged from 0.24 to 0.48 EU/dose. The in vivo pyrogen tests were positive at dilutions of 1/16 to 1/128 and negative at 1/256 in all experiments with samples from 5 vaccine batches at dilutions ranging from 1/16 to 1/256.Conclusions. This study has experimentally proven that the gel-clot test can quantify BE in the typhoid Vi polysaccharide vaccine. The authors have recommended introducing the gel-clot BE test in the monograph of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation on the typhoid Vi polysaccharide vaccine (FS.3.3.1.0012.15).Актуальность. Оценка содержания пирогенных примесей в вакцине брюшнотифозной Ви-полисахаридной (Вианвак®) проводится в настоящее время только биологическим тестом на пирогенность. Определение бактериальных эндотоксинов (БЭ) с помощью гель-тромб теста и введение показателя «Бактериальные эндотоксины» в нормативную документацию на препарат позволят существенно повысить надежность контроля качества данной вакцины, а также гармонизировать требования к ней с требованиями ведущих фармакопей мира к данной группе лекарственных препаратов.Цель. Экспериментальная оценка возможности определения содержания бактериальных эндотоксинов с помощью гель-тромб теста в брюшнотифозной Ви-полисахаридной вакцине.Материалы и методы. Образцы вакцины брюшнотифозной Ви-полисахаридной (раствор для подкожного введения, 0,5 мл/доза) пяти серий; ЛАЛ-реактив; ТАЛ-реактив. Испытания проводились с использованием гель-тромб теста с учетом требований Государственной фармакопеи Российской Федерации (ОФС.1.2.4.0006.15) и теста на пирогенность согласно ОФС.1.2.4.0005.15.Результаты. Расчетное предельное содержание БЭ в испытуемой вакцине составляет 96 ЕЭ/мл, значение максимально допустимого разведения (МДР) — 3200. Установлены нормативные требования к качеству вакцины по показателю «Бактериальные эндотоксины» (не более 48 ЕЭ/доза). Выявлено наличие БЭ в разведениях препарата 1/16–1/32 и отсутствие — в разведениях 1/64–1/256. Выбрано и валидировано рабочее разведение препарата 1/128. Полученные значения содержания БЭ в исследуемых образцах находятся в диапазоне от 0,24 до 0,48 ЕЭ/доза. Испытания на пирогенность in vivo образцов пяти серий вакцины в разведениях от 1/16 до 1/256 показали, что введение животным препарата в разведениях 1/16–1/128 вызывало пирогенную реакцию, а при введении вакцины в разведении 1/256 пирогенная реакция отсутствовала во всех экспериментах.Выводы. Экспериментально доказана возможность определения бактериальных эндотоксинов в вакцине брюшнотифозной Ви-полисахаридной с помощью гель-тромб теста. Рекомендовано введение показателя «Бактериальные эндотоксины» в Государственную фармакопею Российской Федерации ФС.3.3.1.0012.15 «Вакцина брюшнотифозная Ви-полисахаридная»

Изучение вакцины против клещевого энцефалита

Scientific relevance. Tick-borne encephalitis is one of the most significant anthropozoonoses   for public health in the Russian Federation. Wide vaccination coverage is required to control  this zoonotic infection. However, large-scale immunisation is not feasible without developing novel vaccines with improved safety and efficacy profiles, such as vaccines based on the continuous Vero cell line.Aim. This extended study aimed to investigate the key quality attributes of VeroKSEN, a new tick-borne encephalitis vaccine that was obtained using Vero cells.Materials and methods. The authors implemented current approaches to vaccine development, including propagation of tick-borne encephalitis strain 205 (Far Eastern subtype) in Vero cells, fine purification of the viral antigen by size-exclusion chromatography on polymeric resins, and introduction of additional quality control methods. For VeroKSEN production, the authors used the method protected by utility patent No. 2678431.  Quality control of the finished product  was performed according to the State Pharmacopoeia of the Russian Federation. The laboratory study of the vaccine and its intermediates in Balb/с mice used novel control methods developed by the authors. Additional methods included polyacrylamide gel electrophoresis, enzyme immunoassay, immunoblotting with total antibodies to tick-borne encephalitis virus  and monoclonal antibodies to glycoprotein E, reverse transcription–polymerase chain reaction, and high-performance liquid chromatography. The extended potency study used test strains of different subtypes, including Absettarov (Western), Sofjin (Far Eastern), and Korzukhin (Siberian). The authors studied the infectious activity of tick-borne encephalitis virus in outbred mice using the pharmacopoeial titration method. Statistical analysis of the study results involved calculating the arithmetic mean and the root-mean-square deviation.Results. The authors studied the key quality attributes of VeroKSEN and its intermediates. Selected inactivation conditions reduced the infectious activity of the viral harvest to an undetectable level within 24 h, while its antigenic activity remained approximately 100% of the baseline. The fine purification stages and the methods and techniques developed by the authors provided a whole-virion fraction with a purity of up to 98.2% and removed process-related impurities (residual host-cell DNA, bovine serum albumin, formaldehyde, and bacterial endotoxins) to the levels required by national legislation. The stability study demonstrated    that the vaccine met the requirements for up to 36 months.Conclusions. The study showed the high potency of the new vaccine in terms of protection against the Western, Siberian, and Far Eastern subtypes of tick-borne encephalitis, with minimum immunising doses (MID50) of 0.007, 0.00125, and 0.00093 mL, respectively.Актуальность. Клещевой энцефалит — один из наиболее актуальных для здоровья населения России антропозооноз, контроль над которым требует широкого охвата вакцинопрофилактикой. Масштабная вакцинация невозможна без разработки новых вакцин, например с применением перевиваемой линии клеток Vero, обладающих улучшенным профилем безопасности и эффективности.Цель. Расширенное изучение ключевых показателей качества новой  вакцины  «ВероКСЭН» против клещевого энцефалита, полученной с использованием  перевиваемой линии клеток Vero.Материалы и методы. В технологии создания вакцины реализованы современные подходы: накопление производственного штамма вируса клещевого энцефалита № 205 (дальневосточный субтип) в клетках перевиваемой линии Vero; использование для заключительной тонкой очистки вирусного антигена эксклюзионной хроматографии на полимерных сорбентах; введение дополнительных методов контроля. Вакцину «ВероКСЭН» получали способом, описанным в  патенте  на  изобретение  №  2678431.  Контроль  готового  продукта проводили в соответствии с методиками, описанными в Государственной фармакопее Российской Федерации. Для лабораторного изучения  вакцины  и  полупродуктов  на  мышах линии Balb/с  были  разработаны  и  внедрены  оригинальные  новые  методы  контроля, а также применялись: электрофорез в полиакриламидном геле, иммуноферментный анализ, иммуноблот с суммарными антителами против вируса клещевого энцефалита и моноклональными антителами против гликопротеина E,  метод полимеразной цепной  реакции    с обратной транскрипцией, высокоэффективная жидкостная хроматография. При расширенном лабораторном исследовании протективной  активности  использовали  тест-штаммы субтипов «Абсеттаров» (западный), «Софьин» (дальневосточный) и «Корзухин» (сибирский). Оценку инфекционной  активности  вируса  клещевого  энцефалита  проводили  при помощи фармакопейного метода титрования на беспородных мышах. Результаты исследований оценивали при помощи статистических методов анализа с вычислением среднего арифметического и среднеквадратичного отклонения.Результаты. Изучены ключевые показатели качества новой вакцины против клещевого энцефалита «ВероКСЭН» и ее полупродуктов. Показано, что выбранный режим инактивации снижает инфекционную активность вирусного сбора до недетектируемого уровня через 24 ч, при этом антигенная активность сохраняется на уровне около 100%  от  исходного значения.  Этапы тонкой  очистки, а  также разработанные оригинальные методики  и технологии позволили получить цельновирионную фракцию с чистотой до 98,2% и удалить технологические примеси (ДНК клеток-продуцентов, бычий сывороточный альбумин, формальдегид, бактериальные эндотоксины) до уровней, соответствующих нормативным требованиям. Изучение стабильности вакцины на сроке хранения до  36  мес. подтвердило ее соответствие нормативным показателям.Выводы. Новая вакцина обладает высокой специфической активностью в  отношении  вируса клещевого энцефалита для штаммов «Абсеттаров», «Софьин» и «Корзухин»: минимальная иммунизирующая доза (МИД50) составила 0,007, 0,00125 и 0,00093 мл соответственно

Противовирусная активность лекарственного препарата на основе РНК двуспиральной натриевой соли в отношении SARS-CoV-2 in vitro

Scientific relevance. Innate immune activation in the early phases of COVID-19 infection and subsequent interferon induction may help control viral replication and protect cells not yet infected with SARS-CoV-2. Thus, immunostimulants that induce interferon (IFN), including double-stranded RNA-based agents, are a promising means of post-exposure prophylaxis and treatment of COVID-19 at early stages.Aim. The study evaluated the in vitro antiviral activity of a double-stranded RNA sodium salt-based medicinal product against SARS-CoV-2.Materials and methods. The authors analysed the double-stranded RNA sodium salt-based medicinal product RADAMIN®VIRO using Vero cells and the Delta variant of SARS-CoV-2 (B.1.617). The virus titre was calculated as the tissue cytopathic dose that caused 50% cell death. The authors measured the content of IFN-α and IFN-γ in the culture fluid by enzyme immunoassay and assessed the viral load by real-time polymerase chain reaction (using the cycle threshold value) and by titration (using Vero cells).Results. The studied double-stranded RNA sodium salt-based medicinal product at a concentration of 250 or 500 μg/mL induced IFN-α and IFN-γ expression by Vero cells, thus increasing their resistance to SARS-CoV-2. The authors evaluated the antiviral activity of the medicinal product based on the virus titre, viral load, and cell monolayer damage. The antiviral activity became clear 24 h after treatment, which confirmed the ability of the medicinal product to inhibit the replication of the SARS-CoV-2 virus in vitro as early as the first day after infection.Conclusions. The double-stranded RNA sodium salt-based medicinal product induced IFN-α and IFN-γ synthesis in Vero cells, increasing their resistance to SARS-CoV-2 infection in vitro. These results demonstrate the immunomodulatory and antiviral potential of the medicinal product.Актуальность. Активация механизмов врожденного иммунитета на ранних фазах развития инфекции COVID-19 и, как следствие, последующая индукция продукции интерферонов может способствовать контролю репликации вируса и защите еще неинфицированных SARS-CoV-2 клеток. В связи с этим в качестве средств постконтактной профилактики и лечения COVID-19 на ранних этапах представляется перспективным применение иммуностимулирующих препаратов, вызывающих индукцию интерферонов, в том числе препаратов на основе двуспиральной РНК.Цель. Оценка противовирусной активности лекарственного препарата на основе РНК двуспиральной натриевой соли в отношении вируса SARS-CoV-2 in vitro.Материалы и методы. Препарат на основе РНК двуспиральной натриевой соли (РАДАМИН®ВИРО). Эксперименты выполняли на культуре клеток Vero. В исследовании использовали вариант дельта вируса SARS-CoV-2 (B.1.617). Проводили оценку цитопатического действия вируса. Титр вируса рассчитывали как показатель тканевой цитопатической дозы, вызывающей гибель 50% клеток. Содержание интерферонов α и γ в культуральной жидкости определяли с помощью метода иммуноферментного анализа, вирусную нагрузку – методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (по показателю Ct) и титр вируса – титрованием на культуре клеток Vero.Результаты. Внесение препарата на основе РНК двуспиральной натриевой соли в концентрациях 250 мкг/мл и 500 мкг/мл к клеткам линии Vero приводит к индукции секреции интерферонов α и γ, что повышает резистентность клеток к заражению вирусом SARS-CoV-2. Противовирусная активность исследуемого препарата, оцениваемая по значениям показателей титра вируса, вирусной нагрузки и уровня поражения клеточного монослоя, отмечается через 24 ч после его воздействия, что показывает способность препарата задерживать размножение вируса SARS-CoV-2 in vitro уже в течение первых суток после заражения.Выводы. Препарат на основе РНК двуспиральной натриевой соли индуцирует синтез интерферонов α и γ клетками линии Vero, повышая устойчивость клеток к заражению SARS-CoV-2 in vitro, что свидетельствует о иммуномодулирующем и противовирусном потенциале исследованного препарата