Membrane-anchored chemokine fusion proteins as adjuvants for tumor therapy.

Maligne Tumorerkrankungen sind eine der häufigsten Todesursachen der Welt und neue Therapie-möglichkeiten werden dementsprechend dringend benötigt. Einen vielversprechenden Ansatz stellt der adoptive Transfer von Immun-Effektorzellen in Tumorpatienten dar. Die Effizienz dieser Therapieform wird jedoch häufig durch eine unzureichende Rekrutierung der transferierten Leukozyten in das Tumorgewebe eingeschränkt. Aus diesem Grunde wurden in der vorliegenden Studie neuartige Fusionsproteine entwickelt, die spezifisch die Rekrutierung bestimmter Leukozyten verstärken sollten. Die Proteine setzten sich zusammen aus einer N-terminalen Chemokindomäne, der Muzindomäne des membrangebundenen Chemokins CX3CL1 sowie einem C-terminalen Glykosyl-phosphatidylinositol (GPI) Membrananker, der die Transmembrandomäne von CX3CL1 ersetzte. Nach Injektion in einen Tumor sollten sich die Proteine aufgrund des GPI-Ankers in die Zellmembranen von Endothel-, Tumor- und Stromazellen integrieren. Dabei sollte die Chemokindomäne im Zusammenspiel mit der Muzindomäne selektiv Leukozyten rekrutieren, die den korrespondierenden Chemokinrezeptor exprimieren. Für die Rekrutierung zytotoxischer T-Zellen und NK-Zellen wurde zunächst ein Fusionsprotein mit einer CXCL10 Chemokindomäne generiert (CXCL10-mucin-GPI), sowie diverse Varianten des Proteins als Kontrollen. Die Fusionsproteine wurden in eukaryotischen Zellen exprimiert und konnten anschließend mittels FACS und Immunfluoreszenz-Mikroskopie auf der Zellmembran der transfizierten Zellen nachgewiesen werden. Weitere Versuche zeigten, dass die CXCL10 Fusionsproteine den korrespondierenden Chemokinrezeptor CXCR3 aktivieren können. Dies führte in CXCR3-positiven Zellen zu einer Mobilisation von intrazellulärem Calcium, einer Internalisierung von CXCR3 sowie zu einer Verstärkung der Adhäsion an Zelloberflächen. Die GPI-verankerten Fusionsproteine wurden anschließend mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und es konnte gezeigt werden, dass sich die gereinigten Proteine aufgrund ihres GPI-Ankers spontan in Zellmembranen integrieren. In einem in vitro Modell für Rekrutierungsprozesse in Blutgefäßen konnten Endothelzellen nach Behandlung mit CXCL10-mucin-GPI effektiv NK-Zellen in Gegenwart physiologischer Scherkräfte rekrutieren. Vergleiche mit entsprechenden Varianten von CXCL10-mucin-GPI zeigten, dass die Muzindomäne unabdingbar für diesen Effekt war. Im Gegensatz zu NK-Zellen wurden T-Zellen weniger effizient rekrutiert. In einem in vivo Tumor-Modell zeigte sich, dass eine intratumorale Injektion von CXCL10-mucin-GPI zu einer wesentlich stärkeren Rekrutierung von NK-Zellen führt als eine Injektion von löslichem CXCL10. Aus den Versuchen der vorliegenden Studie kann demnach die Schlussfolgerung gezogen werden, dass Fusionsproteine wie CXCL10-mucin-GPI eine vielversprechende Möglichkeit für die gezielte Verstärkung der Rekrutierung von Leukozyten im Rahmen zellulärer Immuntherapien darstellen

Recruitment of natural killer cells in advanced stages of endogenously arising B-cell lymphoma: Implications for therapeutic cell transfer.

During inflammation and in transplantable tumor models, natural killer (NK) cells are recruited to pathologic tissues and activated to produce proinflammatory cytokines favoring adaptive immune responses of the T-helper type 1 (Th1) type. Interferon (IFN)-γ is needed to induce chemokines that attract NK cells in transplanted tumors. Nothing, however, is known on NK-cell migration in spontaneous tumors. As effective recruitment is a prerequisite for therapeutic NK-cell transfer, we investigated the cytokine milieu and the mechanisms that are instrumental for NK-cell accumulation in an endogenous tumor model. We make use of λ-myc transgenic mice that harbor the c-myc oncogene and develop spontaneous B-cell lymphoma. In contrast to lymphomas induced by tumor cell injection, virtually no IFN-γ produced by NK or by other cells was present in the tumor environment, particularly in advanced stages. Dendritic cells showed an impaired expression of interleukin-12, which is suggestive of deficient Th1 priming. The IFN-γ-dependent chemokines CXCL9 and CXCL10 were pivotal for NK-cell migration in the endogenous lymphoma model. Although IFN-γ was absent in late tumor stages, there was still expression of CXCL9 and CXCL10 with an ongoing influx of NK cells. The results demonstrate that transplantable tumor models do not reflect the situation as found in endogenously arising neoplasia, because in the latter, effective Th1 and cytotoxic T-lymphocyte responses are presumably not induced because of impaired IFN-γ production. The data also suggest that CXCL9 and CXCL10 production and NK-cell migration become independent of IFN-γ during tumor progression, and therefore support approaches of adoptive NK-cell transfer that hold promise for treatment of cancer