Membrane-anchored chemokine fusion proteins as adjuvants for tumor therapy.

Abstract

Maligne Tumorerkrankungen sind eine der häufigsten Todesursachen der Welt und neue Therapie-möglichkeiten werden dementsprechend dringend benötigt. Einen vielversprechenden Ansatz stellt der adoptive Transfer von Immun-Effektorzellen in Tumorpatienten dar. Die Effizienz dieser Therapieform wird jedoch häufig durch eine unzureichende Rekrutierung der transferierten Leukozyten in das Tumorgewebe eingeschränkt. Aus diesem Grunde wurden in der vorliegenden Studie neuartige Fusionsproteine entwickelt, die spezifisch die Rekrutierung bestimmter Leukozyten verstärken sollten. Die Proteine setzten sich zusammen aus einer N-terminalen Chemokindomäne, der Muzindomäne des membrangebundenen Chemokins CX3CL1 sowie einem C-terminalen Glykosyl-phosphatidylinositol (GPI) Membrananker, der die Transmembrandomäne von CX3CL1 ersetzte. Nach Injektion in einen Tumor sollten sich die Proteine aufgrund des GPI-Ankers in die Zellmembranen von Endothel-, Tumor- und Stromazellen integrieren. Dabei sollte die Chemokindomäne im Zusammenspiel mit der Muzindomäne selektiv Leukozyten rekrutieren, die den korrespondierenden Chemokinrezeptor exprimieren. Für die Rekrutierung zytotoxischer T-Zellen und NK-Zellen wurde zunächst ein Fusionsprotein mit einer CXCL10 Chemokindomäne generiert (CXCL10-mucin-GPI), sowie diverse Varianten des Proteins als Kontrollen. Die Fusionsproteine wurden in eukaryotischen Zellen exprimiert und konnten anschließend mittels FACS und Immunfluoreszenz-Mikroskopie auf der Zellmembran der transfizierten Zellen nachgewiesen werden. Weitere Versuche zeigten, dass die CXCL10 Fusionsproteine den korrespondierenden Chemokinrezeptor CXCR3 aktivieren können. Dies führte in CXCR3-positiven Zellen zu einer Mobilisation von intrazellulärem Calcium, einer Internalisierung von CXCR3 sowie zu einer Verstärkung der Adhäsion an Zelloberflächen. Die GPI-verankerten Fusionsproteine wurden anschließend mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und es konnte gezeigt werden, dass sich die gereinigten Proteine aufgrund ihres GPI-Ankers spontan in Zellmembranen integrieren. In einem in vitro Modell für Rekrutierungsprozesse in Blutgefäßen konnten Endothelzellen nach Behandlung mit CXCL10-mucin-GPI effektiv NK-Zellen in Gegenwart physiologischer Scherkräfte rekrutieren. Vergleiche mit entsprechenden Varianten von CXCL10-mucin-GPI zeigten, dass die Muzindomäne unabdingbar für diesen Effekt war. Im Gegensatz zu NK-Zellen wurden T-Zellen weniger effizient rekrutiert. In einem in vivo Tumor-Modell zeigte sich, dass eine intratumorale Injektion von CXCL10-mucin-GPI zu einer wesentlich stärkeren Rekrutierung von NK-Zellen führt als eine Injektion von löslichem CXCL10. Aus den Versuchen der vorliegenden Studie kann demnach die Schlussfolgerung gezogen werden, dass Fusionsproteine wie CXCL10-mucin-GPI eine vielversprechende Möglichkeit für die gezielte Verstärkung der Rekrutierung von Leukozyten im Rahmen zellulärer Immuntherapien darstellen