Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model

Endotoxin-induced uveitis (EIU) in rodents is a model of acute Toll-like receptor 4 (TLR4)-mediated organ inflammation, and has been used to model human anterior uveitis, examine leukocyte trafficking and test novel anti-inflammatory therapeutics. Wider adoption has been limited by the requirement for manual, non-specific, cell-count scoring of histological sections from each eye as a measure of disease severity. Here, we describe a comprehensive and efficient technique that uses ocular dissection and multimodal tissue analysis. This allows matched disease scoring by multicolour flow cytometric analysis of the inflammatory infiltrate, protein analysis on ocular supernatants and qPCR on remnant tissues of the same eye. Dynamic changes in cell populations could be identified and mapped to chemokine and cytokine changes over the course of the model. To validate the technique, dose-responsive suppression of leukocyte infiltration by recombinant interleukin-10 was demonstrated, as well as selective suppression of the monocyte (CD11b+Ly6C+) infiltrate, in mice deficient for either Ccl2 or Ccr2. Optical coherence tomography (OCT) was used for the first time in this model to allow in vivo imaging of infiltrating vitreous cells, and correlated with CD11b+Ly6G+ counts to provide another unique measure of cell populations in the ocular tissue. Multimodal tissue analysis of EIU is proposed as a new standard to improve and broaden the application of this model

Differential Modulation of Retinal Degeneration by Ccl2 and Cx3cr1 Chemokine Signalling

Microglia and macrophages are recruited to sites of retinal degeneration where local cytokines and chemokines determine protective or neurotoxic microglia responses. Defining the role of Ccl2-Ccr2 and Cx3cl1-Cx3cr1 signalling for retinal pathology is of particular interest because of its potential role in age-related macular degeneration (AMD). Ccl2, Ccr2, and Cx3cr1 signalling defects impair macrophage trafficking, but have, in several conflicting studies, been reported to show different degrees of age-related retinal degeneration. Ccl2/Cx3cr1 double knockout (CCDKO) mice show an early onset retinal degeneration and have been suggested as a model for AMD. In order to understand phenotypic discrepancies in different chemokine knockout lines and to study how defects in Ccl2 and/or Cx3cr1 signalling contribute to the described early onset retinal degeneration, we defined primary and secondary pathological events in CCDKO mice. To control for genetic background variability, we compared the original phenotype with that of single Ccl2, Cx3cr1 and Ccl2/Cx3cr1 double knockout mice obtained from backcrosses of CCDKO with C57Bl/6 mice. We found that the primary pathological event in CCDKO mice develops in the inferior outer nuclear layer independently of light around postnatal day P14. RPE and vascular lesions develop secondarily with increasing penetrance with age and are clinically similar to retinal telangiectasia not to choroidal neovascularisation. Furthermore, we provide evidence that a third autosomal recessive gene causes the degeneration in CCDKO mice and in all affected re-derived lines and subsequently demonstrated co-segregation of the naturally occurring RD8 mutation in the Crb1 gene. By comparing CCDKO mice with re-derived CCl2−/−/Crb1Rd8/RD8, Cx3cr1−/−/Crb1Rd8/RD8 and CCl2−/−/Cx3cr1−/−/Crb1Rd8/RD8 mice, we observed a differential modulation of the retinal phenotype by genetic background and both chemokine signalling pathways. These findings indicate that CCDKO mice are not a model of AMD, but a model for an inherited retinal degeneration that is differentially modulated by Ccl2-Ccr2 and Cx3cl1-Cx3cr1 chemokine signalling

The severity of retinal pathology in homozygous Crb1rd8/rd8 mice is dependent on additional genetic factors

Understanding phenotype–genotype correlations in retinal degeneration is a major challenge. Mutations in CRB1 lead to a spectrum of autosomal recessive retinal dystrophies with variable phenotypes suggesting the influence of modifying factors. To establish the contribution of the genetic background to phenotypic variability associated with the Crb1(rd8/rd8) mutation, we compared the retinal pathology of Crb1(rd8/rd8)/J inbred mice with that of two Crb1(rd8/rd8) lines backcrossed with C57BL/6JOlaHsd mice. Topical endoscopic fundal imaging and scanning laser ophthalmoscopy fundus images of all three Crb1(rd8/rd8) lines showed a significant increase in the number of inferior retinal lesions that was strikingly variable between the lines. Optical coherence tomography, semithin, ultrastructural morphology and assessment of inflammatory and vascular marker by immunohistochemistry and quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction revealed that the lesions were associated with photoreceptor death, Müller and microglia activation and telangiectasia-like vascular remodelling—features that were stable in the inbred, variable in the second, but virtually absent in the third Crb1(rd8/rd8) line, even at 12 months of age. This suggests that the Crb1(rd8/rd8) mutation is necessary, but not sufficient for the development of these degenerative features. By whole-genome SNP analysis of the genotype–phenotype correlation, a candidate region on chromosome 15 was identified. This may carry one or more genetic modifiers for the manifestation of the retinal pathology associated with mutations in Crb1. This study also provides insight into the nature of the retinal vascular lesions that likely represent a clinical correlate for the formation of retinal telangiectasia or Coats-like vasculopathy in patients with CRB1 mutations that are thought to depend on such genetic modifiers

Elucidation of Molecular Pathogenic Mechanisms of Norrie Disease

# I. # Inhaltsverzeichnis # 0. Titelblatt, Danksagung und Verzeichnisse ### I. ### INHALTSVERZEICHNIS ### IV ### II. ### ABBILDUNGSVERZEICHNIS ### VII ### III. ### ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ### IX 1 EINLEITUNG 1 ### 1.1 ### Die Anatomie des menschlichen Auges ### 1 #### 1.1.1 #### Der Aufbau der Retina und deren Blutgefäßversorgung #### 2 ### 1.2 ### Klinik und Genetik des Norrie-Syndroms ### 5 #### 1.2.1 #### Das klinische Erscheinungsbild des Norrie-Syndroms #### 5 #### 1.2.2 #### Das NDP-Gen und sein Mutationsspektrum in Patienten #### 7 #### 1.2.3 #### Klinische Gemeinsamkeiten der allelischen Erkrankungen und deren genetische Grundlagen #### 9 ### 1.3 ### Eigenschaften des vorhergesagten NDP-Proteins (Norrin) ### 12 ### 1.4 ### Das Ndph-knockout-Mausmodell ### 15 #### 1.4.1 #### Die Herstellung eines Mausmodells für das Norrie-Syndrom und die Expression des Norrie-Gens in Mausgewebe #### 15 #### 1.4.2 #### Phänotypische Charakterisierung des Mausmodells #### 15 ### 1.5 ### Die retinale Blutgefäßentwicklung in Mensch und Maus ### 17 #### 1.5.1 #### Die Entwicklung der retinalen Blutgefäße in Mensch und Maus #### 17 #### 1.5.2 #### Die Rolle der an der retinalen Blutgefäßentwicklung beteiligten Zelltypen #### 20 #### 1.5.3 #### Die koordinierte Wirkung molekularer Signalwege in der Angiogenese #### 22 ### 1.6 ### Zielsetzung der Arbeit ### 25 2 MATERIAL / METHODEN 26 ### 2.1 ### Tiere ### 26 ### 2.2 ### Gewebepräparation und histologische Techniken ### 26 #### 2.2.1 #### Entnahme und Verarbeitung von Geweben #### 27 #### 2.2.2 #### Fixierung und Paraffineinbettung von Gewebe #### 27 #### 2.2.3 #### Hämalaun/Eosin-Färbung #### 27 ### 2.3 ### DNA-Techniken ### 28 #### 2.3.1 #### Agarosegelelektrophorese zur Auftrennung von Nukleinsäuren #### 30 #### 2.3.2 #### Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) #### 30 #### 2.3.3 #### Präparation von Plasmid-DNA #### 31 #### 2.3.4 #### Manipulation von DNA und Transformation von Bakterien #### 31 #### 2.3.5 #### Sequenzierung #### 32 #### 2.3.6 #### Isolation von DNA aus Mausschwanzbiopsien #### 33 #### 2.3.7 #### PCR zur Genotypisierung des Ndph-Wildtyp- oder Knockout-Allels und zur Geschlechtsbestimmung (Sry) #### 33 ### 2.4 ### RNA-Techniken ### 34 #### 2.4.1 #### RNA-Extraktion #### 36 #### 2.4.2 #### Quantifizierung der RNA #### 37 #### 2.4.3 #### DNase I-Behandlung von Total-RNA #### 37 #### 2.4.4 #### DNAse I-Behandlung von Total-RNA (20 μg) mit anschließender Phenol- Chloroform-Extraktion #### 38 #### 2.4.5 #### cDNA-Synthese #### 38 #### 2.4.6 #### TaqMan-Real Time-PCR #### 39 #### 2.4.7 #### Nicht radioaktive RNA-in situ Hybridisierung (DIG) auf Gewebeschnitten #### 40 #### 2.4.8 #### Genexpressionsstudien mit Northern Blots oder virtuellen Northern Blots #### 46 #### 2.4.9 #### Herstellen radioaktiv markierter DNA-Sonden und Hybridisierung von Nukleinsäureblots #### 48 ### 2.5 ### Herstellen einer SMART-cDNA-Subtraktionsbank ### 51 #### 2.5.1 #### Erststrang-SMART-cDNA-Synthese (Smart PCR cDNA Synthesis Kit) #### 56 #### 2.5.2 #### RsaI-Restriktion der SMART-cDNAs #### 58 #### 2.5.3 #### Herstellung des Drivers #### 59 #### 2.5.4 #### Herstellen der Tester #### 60 #### 2.5.5 #### Subtraktive Hybridisierung #### 62 #### 2.5.6 #### "Suppression PCR"-Amplifikation der differentiellen Tester cDNA-Fragmente #### 63 #### 2.5.7 #### Herstellen der Forward- und der Reverse-SMART-cDNA-Subtraktionsbanken #### 65 ### 2.6 ### cDNA-Mikroarray-Techniken ### 66 #### 2.6.1 #### Amplifikation der SMART-cDNA-Subtraktionsbanken zur Herstellung von Mikroarrays #### 68 #### 2.6.2 #### Herstellen der cDNA-Mikroarrays #### 69 #### 2.6.3 #### In dieser Arbeit hergestellte bzw. verwendete cDNA-Mikroarrays #### 70 #### 2.6.4 #### Vorbehandlung der Mikroarrays für die Hybridisierung #### 71 #### 2.6.5 #### Vorbereitung der Targets für die Markierung #### 72 #### 2.6.6 #### Markierung der Targets #### 73 #### 2.6.7 #### Kohybridisierung verschiedener Targets auf cDNA-Mikroarrays #### 76 #### 2.6.8 #### Waschen der Mikroarrays nach der Hybridisierung #### 78 #### 2.6.9 #### Bildgewinnung und Analyse der Mikroarraydaten #### 78 ### 2.7 ### Proteinbiochemische Methoden ### 79 #### 2.7.1 #### Proteinpräparation aus Gewebe #### 82 #### 2.7.2 #### Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA- Assay; 560 nm) #### 83 #### 2.7.3 #### Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS�PAGE) #### 83 #### 2.7.4 #### Nachweis von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen #### 84 #### 2.7.5 #### Transfer von Proteinen auf eine PVDF-Membran (Western Blot) #### 84 #### 2.7.6 #### Rekombinante Ndph ("Norrin")-Proteinexpression in Escherichia coli #### 85 #### 2.7.7 #### Affinitätschromatographische Aufreinigung des rekombinanten Proteins mit Ni-NTA-Agarose über einen RGS-His-Tag #### 88 #### 2.7.8 #### Immunisierung von Kaninchen mit rekombinantem Norrin zur Antikörpergewinnung #### 89 #### 2.7.9 #### Renaturierung des rekombinanten WND-Proteins für die Verwendung in einem Cornea- Vaskularisations-Assay #### 89 ### 2.8 ### Datenbankanalysen und Computerprogramme ### 90 3 ERGEBNISSE 91 ### 3.1 ### Globale Genexpressionsstudien in Augen von Ndph-knockout-Mäusen (p21) ### 91 #### 3.1.1 #### Herstellung einer Forward- und einer Reverse-cDNA-Subtraktionsbank 91 #### 91 #### 3.1.2 #### Herstellung von cDNA-Mikroarrays 97 #### 97 ### 3.2 ### cDNA-Mikroarray-Hybridisierungsexperimente zur Identifizierung ### von differentiell exprimierten Genen. ### 100 #### 3.2.1 #### Vergleichende Datenanalyse der cDNA-Mikroarraydaten 104 #### 104 #### 3.2.2 #### Verifizierung der Arraydaten mit Hilfe virtueller Northern Blots 112 #### 112 ### 3.3 ### Die postnatale Entwicklung der retinalen Blutgefäße in Ndph-knockout- Mäusen ### 113 #### 3.3.1 #### Histologische Untersuchung der Retinaentwicklung in Ndph-knockout-Mäusen #### 113 #### 3.3.2 #### Expression von Angiogenesefaktoren während der postnatalen Retinaentwicklung #### 115 ### 3.4 ### Histologische Untersuchungen und Genexpressionsanalysen im Gehirn von Ndph-knockout-Mäusen ### 120 #### 3.4.1 #### Histologische Untersuchungen im Gehirn #### 120 #### 3.4.2 #### Analyse der Genexpression im Gehirn mit Hilfe eines cDNA-Mikroarrays #### 122 #### 3.4.3 #### Entwicklungsabhängige Transkription des Wachstumshormon-Gens im Gehirn. #### 125 #### 3.4.4 #### Expression des Wachstumshormons in der Hypophyse #### 126 #### 3.4.5 #### Expression zweier Markergene in der Leber für die Gh-Serum-Wirkung #### 127 #### 3.4.6 #### Korrelation zwischen der mRNA-Expression von Ndph und Gh in verschiedenen Hirnregionen. #### 129 #### 3.4.7 #### Untersuchungen zur Transkription von Gh in Auge und Retina #### 132 ### 3.5 ### Identifizierung eines aberranten Ndph-Transkripts in hemizygoten Ndphy/--Mäusen. ### 133 ### 3.6 ### Die Ursache der Infertilität von homozygoten Ndph-/--Weibchen ### 136 #### 3.6.1 #### Die Transmission des Ndph-knockout-Allels in der Knockout-Mauslinie #### 136 #### 3.6.2 #### Histologische Studien an den Implantationsstellen/ Deziduae im Uterus von Ndph-/--Weibchen nach der Einnistung. #### 137 #### 3.6.3 #### Die Expression von NDP/Ndph in Reproduktionsorganen #### 139 ### 3.7 ### Expression eines rekombinanten Ndph-Proteins (Norrin) in Escherichia coli ### 140 ### 3.8 ### Herstellung polyklonaler Antikörper für Norrin ### 142 ### 3.9 ### Cornea-Vaskularisations-Assay mit rekombinantem Norrin ### 145 4 DISKUSSION 147 ### 4.1 ### Untersuchungen zur Funktion des Ndph-Gens im Auge ### 147 #### 4.1.1 #### Herstellung von cDNA-Subtraktionsbanken und deren Charakterisierung mit Hilfe der Mikroarray-Technik. #### 147 #### 4.1.2 #### Die postnatale Retinaentwicklung in Wildtyp und in Ndph-knockout-Mäusen und die Hypoxie #### als wesentlicher Pathogenesemechanismus des Norrie-Syndroms. #### 149 #### 4.1.3 #### Die molekulare Wirkung des Ndph-Gens im Auge #### 155 ### 4.2 ### Die Untersuchungen zur Funktion des Ndph-Gens im Gehirn � Die Dysregulation des Wachstumshormons im Gehirn könnte dem Phänotyp der mentalen Retardierung zu Grunde liegen ### 158 #### 4.2.1 #### Histologische Untersuchung des Gehirns #### 158 #### 4.2.2 #### Globale Genexpressionsstudien im Gehirn von Wildtyp- und Ndph-knockout- Mäusen #### 158 #### 4.2.3 #### Differentielle Genexpression in verschiedenen Hirnregionen als mögliche Ursache der geistigen Behinderung in Norrie-Patienten. #### 160 #### 4.2.4 #### Die Detektion eines artifiziellen Ndph-Fusionstranskripts in Ndph- knockout-Mäusen und die Konsequenzen für das Mausmodell. #### 163 ### 4.3 ### Untersuchungen zur Rolle des Norrins für die Fertilität ### 164 #### 4.3.1 #### Genotypenverteilung #### 165 #### 4.3.2 #### Die Rolle des Norrins während der Dezidua-Bildung #### 165 ### 4.4 ### Rekombinante Expression des Norrins und die Herstellung von Antikörper ### 167 ### 4.5 ### Cornea-Vaskularisations-Assay ### 168 ### 4.6 ### Die Pathogenese des Norrie-Syndroms und die molekulare Wirkung des ### Norrie disease pseudoglioma-Gens/Proteins (�Norrins�) - Ein Ausblick ### 169 5 ZUSAMMENFASSUNG 173 6 SUMMARY 174 7 REFERENZEN 175 8 VERÖFFENTLICHUNGEN 184 ### 8.1 ### Wissenschaftliche Veröffentlichungen ### 184 ### 8.2 ### Kongressbeiträge ### 184 9 LEBENSLAUF 186 10 ANHANG 187 ### 10.1 ### Korrelation der Phänotypen mit Substitutionsmutationen im NDP-Gen ### 187 ### 10.2 ### In dieser Arbeit verwendete Primer ### 190 ### 10.3 ### Sequenz des Ndph-knockout-Transkripts ### 193# Zusammenfassung Das Norrie-Syndrom ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte, kongenitale Blindheit, die mit Taubheit und geistiger Behinderung assoziiert sein kann. In dieser Arbeit sollten molekulare Pathogenesemechanismen dieses Syndroms am Ndph-knockout-Mausmodell aufgeklärt werden. Dabei wurden Expressionsanalysen aber auch histologische und proteinbiochemische Techniken für die Charakterisierung der betroffenen Organe, Auge und Gehirn, angewandt. Die Herstellung von cDNA-Subtraktionsbanken aus Augen (p21) und deren Charakterisierung mit Mikroarrays sowie Blot-Hybridisierungen führten nicht zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene. Dies hängt möglicherweise mit geringen Unterschieden in der Genexpression in diesem frühen Entwicklungsstadium zusammen. Dennoch konnten wir mit quantitativer Real Time- RT-PCR zeigen, dass während der postnatalen Entwicklung der Retina viele Angiogenesefaktoren transkriptionell inhibiert oder stimuliert werden. Dadurch wurde nachgewiesen, dass Endothelzellen durch das Fehlen von Norrin in ihrer extrazellulären Umgebung initial betroffen sind und die Entwicklung der tiefen Kapillarnetzwerke in der inneren Retina blockiert wird. Dies führt zu einer Hypoxie (Sauerstoffmangel) ab p10, die hier als ein wesentlicher Pathogenesefaktor des Norrie-Syndroms identifiziert werden konnte. Diese Befunde können auch ähnliche Symptome bei familiärer exsudativer Vitreoretinopathie (FEVR), bei Morbus Coats und bei Frühgeborenenretinopathie (ROP) erklären. Globale Genexpressionsstudien im Gehirn des Mausmodells identifizierten eine reduzierte Wachstumshormonexpression. Diese trat nur im Gehirn und nicht in der Hypophyse auf, die das endokrinologisch wirksame Wachstumshormon (Gh) produziert. Die hirnspezifische Reduktion des Gh- Transkripts könnte eine mögliche Erklärung für die geistige Behinderung in Norrie-Patienten liefern, wobei der genaue molekulare Zusammenhang noch aufzuklären ist. Ein weiterer, neuer Befund war die Infertilität homozygoter Ndph-knockout-Weibchen. Als deren Ursache konnte eine gestörte Deziduaentwicklung ausgemacht werden. Um E7 verursachen mütterliche Einblutungen in die Dezidua den Verlust der Embryonen. Die hier nachgewiesene Expression von Ndph/NDP in Maus-Deziduae und humaner Plazenta weist auf eine wichtige Funktion des Gens in der weiblichen Reproduktion hin. Schließlich wurde rekombinantes Norrin hergestellt. Die damit gewonnen polyklonalen Antiseren erkannten das Antigen, detektierten aber in Gewebehomogenaten kein Norrin. Die funktionelle Charakterisierung des rekombinanten Norrins im Cornea-Vaskularisations�Assay erbrachte keinen Nachweis einer Funktion des Norrins in der Angiogenese. Insgesamt wiesen die hier gewonnenen Daten Angiogenesedefekte als wichtige Grundlage der Pathogenese des Norrie-Syndroms nach.# Summary Norrie disease (ND) is a rare X-linked recessive congenital blindness, sometimes associated with deafness and mental retardation. In this thesis the molecular pathogenic mechanisms of this syndrome should be elucidated using the Ndph knockout mouse model. Gene expression studies but also histology and protein biochemistry were used to characterize the affected organs, eye and brain. Gene expression analyses of eyes at p21 using cDNA subtraction in combination with microarrays and blot hybridization did not lead to the identification of differentially expressed genes. This might be due to low expression differences early on in the disease. However with quantitative Real Time RT-PCR we could show differential expression of many angiogenic factors during postnatal retinal development, suggesting an early effect of Norrin in the extracellular matrix on endothelial cells. Its lack leads to the block in the development of deep retinal capillary networks. Subsequently hypoxia develops after p10, which we could show to be an important pathogenic factor for Norrie disease. It is likely that it is also the molecular basis for similarities of the clinical Symptoms of the related diseases familial exudative vitreoretinopathie, coats disease and retinopathy of prematurity. Global gene expression studies in the brain of ND-mice identified a reduction of growth hormone expression. This reduction occurs specifically in the brain, but not in pituitary, where the endocrine active growth hormone (Gh) is produced. The brain-specific reduction of the Gh transcript might provide for the first time a possible explanation for the mental retardation in Norrie disease patients, although the molecular link remains to be elucidated. Also for the first time, the infertility of homozygous Ndph knockout female mice was found. The underlying cause was identified to be a disturbance in decidualization. Around E7 maternal bleedings into implantation sites have been discovered leading to loss of embryos by resorption. Additionally, the expression of Ndph/NDP in deciduae of mice and in human placenta also suggested an important function of this gene in female reproduction. In addition, recombinant Norrin was produced. The obtained polyclonal anti-sera detected the antigen but could not detect Norrin in tissue homogenates. The functional characterization of the recombinant Norrin in a cornea vascularization assay could not prove the role of Norrin in angiogenesis. Altogether the here obtained data suggested angiogenic defects as an important basis for pathogenesis in Norrie disease

Fetal loss in homozygous mutant Norrie disease mice: A new role of Norrin in reproduction

Mutations in the Norrie disease pseudoglioma gene (NDP) are known to cause X-linked recessive Norrie disease. In addition, NDP mutations have been found in other vasoproliferative retinopathies such as familial exudative vitreoretinopathy, retinopathy of prematurity, and Coats disease, suggesting a role for Norrin in vascular development. Here we report that female mice homozygous for the Norrie disease pseudoglioma homolog (Ndph) knockout allele exhibit almost complete infertility, while heterozygous females and hemizygous males are fertile. Histological examinations and RNA in situ hybridization analyses revealed defects in vascular development and decidualization in pregnant Ndph-/- females from embryonic day 7 (E7) onwards, resulting in embryonic loss. Using RT-PCR analyses we also demonstrate, for the first time, the expression of Ndph in mouse uteri and deciduae as well as the expression of NDP in human placenta. Taken together, these data provide strong evidence for Norrin playing an important role in female reproductive tissues

Role of the Norrie Disease Pseudoglioma Gene in Sprouting Angiogenesis during Development of the Retinal Vasculature

Purpose: To characterize developmental defects and the time course of Norrie disease in retinal and hyaloid vasculature during retinal development and to identify underlying molecular angiogenic pathways that may be affected in Norrie disease, exudative vitreoretinopathy, retinopathy of prematurity, and Coats' disease. Methods: Norrie disease pseudoglioma homologue (Ndph)-knockout mice were studied during retinal development at early postnatal (p) stages (p5, p10, p15, and p21). Histologic techniques, quantitative RT-PCR, ELISA, and Western blot analyses provided molecular data, and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) angiography and electroretinography (ERG) were used to obtain in vivo data. Results: The data showed that regression of the hyaloid vasculature of Ndph-knockout mice occurred but was drastically delayed. The development of the superficial retinal vasculature was strongly delayed, whereas the deep retinal vasculature did not form because of the blockage of vessel outgrowth into the deep retinal layers. Subsequently, microaneurysm-like lesions formed. Several angiogenic factors were differentially transcribed during retinal development. Increased levels of hypoxia inducible factor-1alpha (HIF1alpha) and VEGFA, as well as a characteristic ERG pattern, confirmed hypoxic conditions in the inner retina of the Ndph-knockout mouse. Conclusions: These data provide evidence for a crucial role of Norrin in hyaloid vessel regression and in sprouting angiogenesis during retinal vascular development, especially in the development of the deep retinal capillary networks. They also suggest an early and a late phase of Norrie disease and may provide an explanation for similar phenotypic features of allelic retinal diseases in mice and patients as secondary consequences of pathologic hypoxia

Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation

Despite different aetiologies, age-related macular degeneration and most inherited retinal disorders culminate in the same final common pathway, the loss of photoreceptors. There are few treatments and none reverse the loss of vision. Photoreceptor replacement by transplantation is proposed as a broad treatment strategy applicable to all degenerations. Recently, we demonstrated restoration of vision following rod-photoreceptor transplantation into a mouse model of stationary night-blindness, raising the critical question of whether photoreceptor replacement is equally effective in different types and stages of degeneration. We present a comprehensive assessment of rod-photoreceptor transplantation across six murine models of inherited photoreceptor degeneration. Transplantation is feasible in all models examined but disease type has a major impact on outcome, as assessed both by the morphology and number of integrated rod-photoreceptors. Integration can increase (Prph2(+/Δ307)), decrease (Crb1(rd8/rd8), Gnat1(-/-), Rho(-/-)), or remain constant (PDE6β(rd1/rd1), Prph2(rd2/rd2)) with disease progression, depending upon the gene defect, with no correlation with severity. Robust integration is possible even in late-stage disease. Glial scarring and outer limiting membrane integrity, features that change with degeneration, significantly affect transplanted photoreceptor integration. Combined breakdown of these barriers markedly increases integration in a model with an intact outer limiting membrane, strong gliotic response, and otherwise poor transplantation outcome (Rho(-/-)), leading to an eightfold increase in integration and restoration of visual function. Thus, it is possible to achieve robust integration across a broad range of inherited retinopathies. Moreover, transplantation outcome can be improved by administering appropriate, tailored manipulations of the recipient environment.</p