Funktionelle Genanalyse ausgewählter Albuminurie-Kandidatengene im Zebrafischmodell

Der erhöhte renale Albuminverlust (UAlb) ist ein mögliches Symptom einer gestörten glomerulären Filtration. Die Messung der UAlb ist im klinischen Gebrauch etabliert. Relevant ist sie insbesondere für die Diagnostik, Stadieneinteilung und Prognostik epidemiologisch bedeutsamer chronischer Nierenerkrankungen. Bereits eine geringfügig erhöhte UAlb im Sinne einer Mikroalbuminurie wurde mit einer erhöhten renalen und kardiovaskulären Mortalität und Morbidität assoziiert. Vor diesem Hintergrund ist die detaillierte Analyse der Ursachen und Pathomechanismen der Albuminurie sinnvoll. Im Rahmen dieser Arbeit sollten drei in einem Rattenmodell identifizierten Kandidatengene für Albuminurie, tmem63c, pomt2 und noxred1, mit Hilfe funktioneller Genanalysen beim Zebrafisch untersucht werden. Der Pronephros des Zebrafischs verfügt ebenso wie die menschliche Niere über Nephrone als zentrale Funktionseinheiten. Ausgeprägte anatomische und funktionelle Parallelen zur glomerulären Filtrationsbarriere (GFB) des Menschen machen ihn zu einem sehr gut geeigneten Modellorganismus in der nephrologischen Forschung. Die Grundlage der funktionellen Genanalysen bildeten CRISPR/Cas9-basierte Funktionsverluststudien. Der Knockdown der Kandidatengene erfolgte bei Zebrafischembryonen im Einzellstadium. Es kamen zwei transgene Zebrafischlinien zum Einsatz, die strukturelle und funktionelle Analysen zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten ermöglichten. Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung des Pronephros bei der Linie Tg(wt1b:EGFP) erfolgte 48 Stunden nach der Befruchtung (hours post fertilization, hpf), um dessen strukturelle Integrität zu beurteilen. Eine funktionelle Untersuchung der GFB wurde 120 hpf bei der Linie Tg(fabp10a:gc-EGFP) durchgeführt. Hierzu wurde die intravasale Konzentration des fluoreszierenden Tracerproteins gc-EGFP fluoreszenzmikroskopisch beurteilt, um Rückschlüsse auf einen renalen Proteinverlust zu ziehen. Das Protein ist bezüglich seiner molekularen Eigenschaften mit Humanalbumin vergleichbar und als dessen Surrogat etabliert. Im Rahmen der Analyse 48 hpf wurde in allen Gruppen die grundsätzliche strukturelle Integrität des Pronephros nachgewiesen. Tiefgreifende Entwicklungsstörungen in Folge der durchgeführten Versuche wurden ausgeschlossen. In der funktionellen Untersuchung der GFB konnten alle Kandidatengene mit einer verminderten intravasalen gc-EGFP-Konzentration assoziiert werden. Dies manifestierte sich unter anderem in einer signifikanten Reduktion des Anteils stark fluoreszierender Larven nach Knockdown von tmem63c (p < 0,0002), pomt2 (Exon 2) (p < 0,02) und noxred1 (p < 0,02) im Vergleich zur Kontrolle. Die Reduktion der intravasalen gc-EGFP-Konzentration bei Larven der Linie Tg(fabp10a:gc-EGFP) spricht für eine funktionelle Beeinträchtigung der pronephrischen GFB und stellt ein Surrogat für einen renalen Albuminverlust dar. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen eine Bedeutung von tmem63c, pomt2 und noxred1 für die normale GFB-Funktion beim Zebrafisch und bestätigen ihre zuvor erfolgte Identifikation als Kandidatengene für Albuminurie. Sie leisten einen Beitrag zum besseren pathogenetischen Verständnis der Albuminurie. Weiterführende Untersuchungen beim Zebrafisch und beim Humanpatienten sollen die Erkenntnisse ergänzen, um neue therapeutische Targets zu identifizieren.Increased urinary albumin excretion (UAE) represents a possible sign of impaired glomerular filtration barrier (GFB) function. It serves as a well-established parameter for diagnosis and clinical staging of chronic kidney disease (CKD). Even slight elevations of UAE as defined by the term microalbuminuria have been associated with increased risk of renal and cardiovascular morbidity and mortality. In addition to the considerable epidemiological relevance of CKD, this raises the need for a detailed pathogenetic understanding of albuminuria. Here, three previously identified candidate genes for albuminuria, namely tmem63c, pomt2 and noxred1, were investigated in the zebrafish model to analyze their potential role for albuminuria development and integrity of the GFB. Like the human kidney, the zebrafish pronephros consists of central elements called nephrons. Extensive anatomical and physiological similarities with the human GFB make it a very suitable model organism for nephrological studies. CRISPR/Cas9-mediated loss-of-function studies were performed on one-cell-stage zebrafish embryos. Two transgenic lines were used to facilitate structural and functional analyses at different developmental stages. At 48 hours post fertilization (hpf), structural integrity of glomeruli and tubuli of Tg(wt1b:EGFP)-embryos was assessed using fluorescence microscopy. At 120 hpf, intravascular fluorescence was determined optically in Tg(fabp10a:gc-EGFP)-larvae to evaluate glomerular leakage of the fluorescent tracer protein gc-EGFP. This protein shares molecular characteristics with human albumin and serves as its well-established surrogate. The analysis at 48 hpf showed generally preserved integrity of pronephric structures in all groups. Severe developmental impairment as a result of the executed procedures could be ruled out. At 120 hpf, the functional in vivo-analysis of the GFB in Tg(fabp10a:gc-EGFP)-larvae revealed an association of all candidate genes with significant reduction of intravascular gc-EGFP. The manifestation of this phenotype included a reduction of strongly fluorescent larvae after knockdown of tmem63c (p < 0.0002), pomt2 (Exon 2) (p < 0.02) and noxred1 (p < 0.02) as compared to control larvae. The reduced intravascular concentration of gc-EGFP indicates a functional impairment of the pronephric GFB after knockdown of candidate genes. This serves as a disease model for albuminuria. These findings support the significance of tmem63c, pomt2 and noxred1 for normal GFB function in zebrafish and confirm their previously established role as candidate genes for albuminuria. Results of this thesis might facilitate a more detailed understanding of albuminuria and serve as a basis for further investigation in zebrafish and human patients

Analysis of the genomic architecture of a complex trait locus in hypertensive rat models links <i>Tmem63c</i> to kidney damage

Unraveling the genetic susceptibility of complex diseases such as chronic kidney disease remains challenging. Here, we used inbred rat models of kidney damage associated with elevated blood pressure for the comprehensive analysis of a major albuminuria susceptibility locus detected in these models. We characterized its genomic architecture by congenic substitution mapping, targeted next generation sequencing, and compartment-specific RNA sequencing analysis in isolated glomeruli. This led to prioritization of transmembrane protein Tmem63c as a novel potential target. Tmem63c is differentially expressed in glomeruli of allele-specific rat models during onset of albuminuria. Patients with focal segmental glomerulosclerosis exhibited specific TMEM63C loss in podocytes. Functional analysis in zebrafish revealed a role for tmem63c in mediating the glomerular filtration barrier function. Our data demonstrate that integrative analysis of the genomic architecture of a complex trait locus is a powerful tool for identification of new targets such as Tmem63c for further translational investigation