Cerebral creatine deficiency syndromes: 13 years experience in Portugal

Os síndromes da deficiência em creatina cerebral são um grupo de erros inatos do metabolismo da creatina que incluem as deficiências de síntese da creatina: arginina:glicina amidinotransferase (AGAT) e S-adenosil- L-metionina:guanidinoacetato metiltransferase (GAMT) e a deficiência no transportador transmembranar (CT1/SLC6A8). O diagnóstico destas patologias pode ser efetuado através da determinação do ácido guanidinoacético e creatina urinária e plasmática e do estudo molecular. Desde 2003 que a Unidade de Rastreio Neonatal, Metabolismo e Genética (URN) disponibiliza este tipo de diagnóstico que permitiu a identificação de nove doentes com deficiência em GAMT e 20 doentes com deficiência em CT1. O rastreio bioquímico das deficiências em creatina cerebral deve ser realizado em todos os doentes que apresentem encefalopatia epiléptica de causa desconhecida, doença do movimento, alterações cognitivas e comportamento tipo autista.Cerebral creatine deficiency syndromes are a group of rare inborn errors of creatine metabolism that include arginine:glycine amidinotransferase (AGAT) deficiency, S-adenosyl-L-methionine:guanidinoacetate methyltransferase (GAMT) deficiency, and the creatine transporter (CT1/SLC6A8) deficiency. All creatine disorders can be investigated through measurement of creatine metabolites in body fluids, and molecular genetics techniques. Since 2003, we have been performing the diagnosis of this group of disorders and encountered nine patients with GAMT deficiency and 20 with CT1 deficiency in the Portuguese population. Biochemical screening for creatine deficiency syndromes should be part of diagnostic workup for all patients presenting with epileptic encephalopathy of unknown origin, movement disorders, mental disability, and autistic-like behavior.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Estudo das bases moleculares da cistinúria na população portuguesa

Mestrado em Biologia Molecular e CelularA cistinúria é uma doença genética autossómica recessiva com uma prevalência variável, afectando cerca de 1/7000 indivíduos. Caracteriza-se por um transporte deficiente de cistina e aminoácidos básicos (lisina, arginina e ornitina) através das células epiteliais dos túbulos renais proximais e do tracto gastrointestinal. A alta concentração de cistina no tracto urinário leva à formação de cálculos renais. O quadro clínico desenvolvido pelos doentes é resultante da urolitíase cursando com cólicas e infecções urinárias de repetição, evoluindo por vezes para insuficiência renal. Com base na excreção dos aminoácidos básicos e cistina definem-se dois tipos de fenótipo: tipo I e tipo não I. Os heterozigotos tipo I têm aminoacidúria normal, enquanto os heterozigotos do tipo não I têm, habitualmente, excreção aumentada cistina e aminoácidos básicos. Nos últimos anos foi proposta uma nova classificação de cistinúria baseada nos aspectos genéticos da doença: cistinúria tipo A, causada por mutações no gene SLC3A1 (localizado em 2p16.3-21 e codificante da subunidade rBAT), tipo B, causada por mutações no gene SLC7A9 (localizado em 19q12- 13.1 e codificante da subunidade b0,+AT) e tipo AB, com hereditariedade digénica. A prevalência dos tipos A e B é semelhante, mas o tipo AB tem uma frequência muito baixa, pelo que persistem dúvidas quanto à herança digénica. O objectivo deste trabalho consistiu no levantamento das famílias portuguesas com cistinúria e no estudo das bases moleculares da cistinúria na nossa população, a fim de se estabelecer um diagnóstico definitivo nos casos, estabelecer uma relação entre a excreção de aminoácidos e determinados genótipos, possibilitar a identificação de genótipos de risco de nefrolitíase e compreender melhor a patologia. A amostra seleccionada para este estudo incluiu 12 doentes e respectivos familiares com diagnóstico clínico e/ou bioquímico de cistinúria. Foi utilizada uma amostra de urina para estudo do perfil dos aminoácidos por cromatografia líquida de troca-iónica e DNA genómico para realizar o estudo molecular dos genes SLC3A1 e SLC7A9. Em três famílias também foi efectuada uma análise ao c.DNA. Foram detectadas 15 alterações na sequência do gene SLC3A1, cinco das quais novas, sendo três patogénicas c.611-2A>C (mutação de splicing), c.1190A>C (ou p.Y397C) e c.15997>A (ou p.Y533N) ambas mutações missense; e duas variações consideradas não patogénicas c.*70A>G e c.1136+44G>A. No gene SLC7A9 foram encontradas 24 alterações de sequência, três das quais não tinham sido previamente descritas na literatura: duas correspondem a substituições por codões homólogos c.216>T (ou p.C72C) e c.1119G>A (ou p.S373S), e uma localizada na extremidade 3’- c*82C>T. A identificação das bases moleculares da cistinúria na população portuguesa irá proporcionar conhecimento científico que contribuirá para o melhor reconhecimento da patologia e oferecer informação complementar para o aconselhamento genético e um diagnóstico definitivo às famílias.Cystinuria is an autosomal-recessive genetic disorder. Its worldwide prevalence varies considerably, affecting approximately 1 in 7 000 people. The disorder is characterized by an impaired transport of the amino acids cystine, ornithine, lysine, and arginine due to a defective subunit of the transporter molecule located in the proximal renal tubule and gastro-intestinal cells. The natural history of cystinuria is marked by recurrent episodes of stone formation, which has been shown to be associated with chronic urinary tract infections, renal impairment and end-stage renal failure in some cases. Based on the excretion of cystine and dibasic amino acids in urine, two types of cystinuria were identified: Type I and non-type I. Type I follows an autosomal recessive trait, and heterozygotes show a normal amino aciduria. In contrast, non-type I heterozygotes exhibit increased excretion of cystine and the dibasic amino acids. Two genes have been reported so far to account for the genetic basis of cystinuria. The SLC3A1 gene located on chromosome 2p16.3-21 and the SLC7A9 gene located on chromosome 19q12-13.1 and a new classification of cystinuria was proposed based on genetic data: cystinuria type A if it is caused by mutations on SLC3A1 gene (that codifies for rBAT subunit), type B involving mutations on SLC7A9 gene (which codifies for b0,+AT subunit), and type AB if there is a digenic inheritance. The prevalence of both types A and B is quite similar according with bibliography, nevertheless type AB is so low that there are doubts if it really exists. The main objective of this investigation was to collect Portuguese families with cystinuria and to investigate molecular bases of cystinuria in our population in order to reach a final diagnosis, establish a relation between biochemical and molecular data, recognize genotypes with higher risk for nephrolithiasis and to contribute for a better understanding of the disease. For this investigation we selected a cohort of 12 patients with clinical and/or biochemical diagnosis of cystinuria as well as their relatives. An urine sample was collected for amino acids analysis by liquid-chromatography and blood for DNA extraction and screening for mutations on SLC3A1 and SLC7A9 genes. In 3 families cDNA was also studied. Fifteen alterations on SLC3A1 gene sequence were detected, five of them were novel: three were classified as real mutations c.611-2A>C (splicing mutation), c.1190A>C (p.Y397C), c.15997>A (p.Y533N) these as missense mutations; and two variations without clinical significance c. *70A>G and c.1136+44G>A. On SLC7A9 gene 24 sequence alterations were identified, three of them were not previously reported; two are substitutions by identical codons c.216>T (p.C72C) and c.1119G>A (p.S373S), and c*82C>T. . The identification of molecular bases of cystinuria in portuguese population will contribute for improving the knowledge of this disease and to offer additional information for genetic counseling and a definite diagnosis of affected patients

McArdle disease: mutational spectrum of Portuguese patients

McArdle disease or Glycogen Storage Disease type V (GSD V; myophosphorylase deficiency; MIM 232600) its an inborn error of glycogen metabolism, caused by a deficiency in muscle specific isoform of glycogen phosphorylase. This metabolic myopathy is characterised by exercise intolerance, myalgia, cramps and episodic myoglobinuria, symptoms that usually appear during the second or third decade of life. The diagnosis was typically made in muscle biopsy by histological analysis (demonstration of subsarcolemmal glycogen deposits and negative histochemical stain for phosphorylase) and/or measurement of muscle phosphorylase activity. Although since 1984, when the gene of muscle isoform of phosphorylase (myophosphorylase) was cloned and assigned to chromosome 11 (11q13), molecular genetics analysis has been more and more used to confirm the clinical diagnosis. Until now, 146 pathogenic mutations have been described (according to HGMDTM) including nonsense, missense and framshift mutations. High genetic heterogeneity is a hallmark of McArdle disease with a very frequent common mutation among Caucasian populations – R49X (present in about 60% of the mutated alleles) – and several rare mutations, without a clear genotype/phenotype correlation. The authors will present molecular data from the characterisation of 53 Portuguese patients, from 42 families, with McArdle disease. Our results reveal the presence of the R49X mutation in 60 of the alleles (57%), in accordance to what has been described to other Caucasian populations, being identified a total of 15 different mutations were identified. These results allowed in many cases the diagnosis without the need of a muscle biopsy, but also provide valuable information for genetic counselling and to increase the knowledge about the molecular pathology of this disorder

Influence of pharmacogenetic variants on drug use: importance of the DPYD gene as a predictive marker of fluoropyrimidine toxicity

A presença de determinadas variantes em genes responsáveis pela codificação de proteínas com função de transportadores ou recetores envolvidos em vias de metabolização de xenobióticos, pode condicionar a resposta individual a determinados fármacos, comprometendo a resposta terapêutica e o prognóstico clínico. Desta forma, a farmacogenética é, nos tempos atuais, uma ferramenta essencial na medicina personalizada, uma vez que estudos genéticos permitem ao clínico prever a probabilidade de eficácia e de toxicidade de determinados fármacos, podendo assim individualizar o tratamento e melhorar a segurança dos doentes. A título de exemplo, podemos referir as variantes associadas ao gene FMO3 (Trimetilaminúria) que condicionarão a eficácia do tratamento com Sulindac, variantes no gene CBS (Homocistinúria clássica) que influenciarão a resposta dos doentes à terapia com Piridoxina (vitamina B6) bem como as variantes no gene DPYD (deficiência em dihidropirimidina desidrogenase) que originarão diferentes manifestações fenotípicas em indivíduos tratados com fluoropirimidinas (5-Fluorouracil, Capecitabina e Tegafur). O objetivo deste trabalho é alertar para a necessidade do estudo genético de indivíduos em tratamento com fármacos que sofram metabolização hepática. Pretende-se avaliar a importância de variantes já identificadas no gene DPYD, bem como de outras potencialmente relevantes, enquanto marcadores preditivos de toxicidade associada às fluoropirimidinas. Este estudo também contribuirá para alargar o espectro mutacional associado ao gene DPYD, para além das variantes incluídas nos kits comerciais do gene, que podem também influenciar a terapêutica/toxicidade com fluoropirimidinas.The presence of certain variants in genes responsible for encoding transporters or receptors involved in xenobiotic metabolism pathways can influence an individual's response to certain drugs, compromising therapeutic efficacy and clinical prognosis. Therefore, pharmacogenetics is currently an essential tool in personalized medicine, as genetic studies allow clinicians to predict the likelihood of efficacy and toxicity of specific drugs, enabling individualized treatment and improving patient safety. As an example, we can mention variants associated with the FMO3 gene (Trimethylaminuria) that affect the effectiveness of Sulindac treatment, variants in the CBS gene (Classical homocystinuria) that influence patients' response to Pyridoxine (vitamin B6) therapy, as well as variants in the DPYD gene (dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency) that result in different phenotypic manifestations in individuals treated with fluoropyrimidines (5-Fluorouracil, Capecitabine, and Tegafur). The aim of this study is to highlight the need for genetic testing of individuals undergoing treatment with drugs that undergo hepatic metabolism. Additionally, we intend to evaluate the importance of already identified variants in the DPYD gene, as well as other potentially relevant ones, as predictive markers for fluoropyrimidine-associated toxicity. Furthermore, we also aim to contribute to expanding the mutational spectrum associated with the DPYD gene, beyond the variants included in commercial gene kits, which could also influence the therapy/toxicity of fluoropyrimidines.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

DESVENDAR “DEScobrir, VENcer as Doenças rARas”

As Doença Raras apresentam uma incidência inferior a 5 casos em cada 10.000 pessoas, estando identificadas cerca de 7.000 a nível mundial, das quais 80% são origem genética. Estima-se que em Portugal existam 600.000 a 800.000 doentes portadores destas patologias. O projeto de investigação DESVENDAR “DEScobrir, VENcer as Doenças rARas”, financiado pelo Norte 2020 (NORTE-01-0246-FEDER-000014), possibilitou a implementação da tecnologia de sequenciação de nova geração (NGS) no nosso laboratório, contribuiu para grandes avanços no diagnóstico genético das doenças hereditárias do metabolismo, uma vez que tem a capacidade de gerar uma enorme quantidade de dados num curto espaço de tempo e a um custo acessível, fornecendo informações importantes aos profissionais de saúde e aos doentes, no âmbito da medicina personalizada. A translação de conhecimentos de NGS para a área de prestação de serviços permite obter um diagnóstico preciso destas doenças raras, detetar com maior celeridade a existência de casos semelhantes e diminuir o peso no Sistema Nacional de Saúde devido a tratamentos paliativos prolongados e pouco específicos. Esta investigação translacional está a capacitar o nosso país com novas abordagens tecnológicas, reforçando o nosso Centro como laboratório de referência para o estudo destas patologias.Rare Diseases have an incidence of less than 5 cases per 10.000 people, with around 7.000 identified worldwide, being 80% of genetic origin. It is estimated that in Por tugal there are 600,000 to 800,000 patients with rare diseases. The research project DESVENDAR “DEScobrir, VENcer as Doenças rARas”, funded by Nor te 2020 (NORTE-01-0246-FEDER- 000014), allowed the implementation of Next Generation Sequencing (NGS) technology in our laborator y, which is underlying major advances in genetic diagnosis of rare metabolic diseases, as it has the capacity to generate a huge amount of data in a shor t time and at an af fordable cost, providing practical information to health professionals and patients within the scope of personalized medicine. The translation of NGS knowledge to the laboratorial routine is facilitating a better understanding of these rare diseases and is allowing a quicker detection of similar cases, reducing the costs in the national health system due to prolonged and unspecific palliative treatments. This translational research is enabling our countr y with new technological approaches, strengthening our Center as a reference laborator y for the study of these pathologies.Ao Norte 2020 pelo financiamento deste projeto de investigação (NORTE-01-0246-FEDER-000014 DESVENDAR “DEScobrir, VENcer as Doenças rARas”).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Metabolic causes of rhabdomyolysis associated with LPIN1 mutations

A rabdomiólise resulta da lise do músculo-esquelético, devido à lesão no tecido muscular com consequente libertação de componentes intracelulares do músculo para a corrente sanguínea, originando mioglobinúria e, nos casos mais graves, falência renal aguda. As causas mais frequentes de rabdomiólise são o consumo de álcool, drogas, exercício físico intenso, compressão muscular traumática e infeções. As miopatias metabólicas são causas de rabdomiólise e decorrem da incapacidade em produzir a quantidade de ATP adequada às necessidades das células musculares, por deficiência de enzimas do metabolismo dos glícidos, lípidos ou nucleósidos. Normalmente surgem na infância, sob a forma de fraqueza muscular e mioglobinúria recorrentes após exposição a estímulos que em condições normais não causam necrose muscular, como é o caso do exercício físico ligeiro, infeções virais ou jejum prolongado. Estas doenças são normalmente causadas por defeitos na -oxidação mitocondrial dos ácidos gordos, no entanto alterações no metabolismo da Lipina constituem a segunda causa mais comum de rabdomiólise com início precoce. Esta deficiência é autossómica recessiva e está associada a mutações no gene LPIN1. Neste sentido foi implementado este estudo genético na nossa Unidade, o que permitiu a identificação do primeiro doente português com uma nova mutação no gene LPIN1. Este estudo contribuiu para esclarecer a causa da doença nesta família, expandir o espectro mutacional deste gene, assim como oferecer um aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal às famílias afetadas. Os nossos dados corroboram assim a importância do estudo molecular do gene LPIN1 para confirmar doentes (crianças e adultos) com rabdomiólise recorrente. A caraterização molecular destes doentes é importante uma vez que existe a possibilidade de um tratamento adequado.Rhabdomyolysis results from damage in skeletal muscle fibres and release of intracellular components of the muscle to the bloodstream, which leads to myoglobinuria, and in severe cases, acute renal failure. The most frequent causes of rhabdomyolysis are alcohol and other drugs consumption, excessive physical activity, trauma and infections. As metabolic myopathies are causes of rhabdomyolysis and result from the inability to produce an adequate amount of ATP for muscle needs, due to enzymatic deficiencies in carbohydrates, lipids or nucleosides metabolism. Usually occur in childhood and are expressed by pain, muscle weakness and myoglobinuria after physical exercise, viral infections or fasting, which under normal conditions do not cause muscle necrosis. These diseases are frequently caused by defects in mitochondrial fatty acids -oxidation, however defects in lipin metabolism represent the second most common cause of rhabdomyolysis with early onset. This disease is autosomal recessive and is associated with LPIN1 mutations. This genetic study was implemented in our Unit and allowed the identification of the first Portuguese patient with a novel mutation in LPIN1 gene, which contributes to clarify the cause of the disease in this family, to expand the mutational spectrum of this gene and will be important for an accurate genetic counseling. Our data corroborate the importance of the molecular study of the LPIN1 gene to confirm recurrent rhabdomyolysis in children and adults. The molecular characterization of these patients is important as there is a possibility of an adequate treatment

Genotype/phenotype correlation in Glycogen Storage Disease type IX

Glycogen Storage Diseases type IX (GSD IX) are caused by a deficient activity of glycogen phosphorylase kinase and are due to mutations in PHKA1, PHKA2, PHKB or PHKG2. The first two genes are X-linked while the latter two follow an autosomal recessive inheritance. It is a common form of glycogenosis and collectively, defects in these genes are responsible for 25% of all cases of GSD, occurring with a frequency of 1 100,000 live births, with the majority of patients presenting mutation in the X-linked PHKA2 (75% of the cases). Infants with GSD IX present with hepatomegaly, growth retardation and elevated transaminases. Ketotic hypoglycemia and hypotonia may also be present. It most of situations it is a mild GSD, with a benign course, with patients becoming asymptomatic as they grow up. Nevertheless, patients with mutations in the subunit γ (PHKG2) have been associated to more severe phenotypes including increased risk of liver cirrhosis or hepatocelular carcinoma. Our laboratory performs the molecular characterisation of Glycogen Storage Diseases type IX for seven years now (since 2008) and a total of thirteen patients were molecularly diagnosed. From these nine (eight males and one female) present mutation in the X-linked PHKA2, while the remaining three had mutations in PHKG2. Those with mutations in PHKG2 present severe phenotypes, resembling other hepatic GSD’s like GSD I and GSD III, in contrast to those with mutations in PHKA2. Our results allowed not only an easier confirmation of the clinical diagnosis, but also contribute to establish better follow up protocols according to the genotype

Estudos moleculares de Erros Inatos do Metabolismo- Contributo da Unidade de Rastreio Neonatal Metabolismo e Genética no diagnóstico das Doenças Raras

A designação “erros inatos do metabolismo” (EIM) surge pela primeira vez no início do século XX, em 1908, por Archibold Garrod, usando o termo para se referir a algumas situações clínicas. Nos seus estudos sobre a Alcaptonúria, constatou que todos os doentes excretavam grande quantidade de ácido homogentísico na urina e que a transmissão da patologia podia ser explicada recorrendo às leis de Mendel. Mais tarde, postulou que certas doenças surgem devido à ausência de uma enzima que catalisa um passo específico de uma via metabólica, introduzindo assim novos conceitos como via metabólica, bloqueio metabólico e erro inato do metabolismo. A partir destas definições foram feitas várias classificações para os EIM, sendo a mais utilizada a que os divide em três grupos principais: Grupo 1 - Defeito da síntese ou degradação de moléculas complexas, Grupo 2 - Defeito do metabolismo intermediário, Grupo 3 - Defeito na produção ou utilização de energia. As Doenças Hereditárias do Metabolismo (DHM) são doenças raras de natureza genética em que a metabolização de um determinado composto se encontra comprometida. Na sua origem está uma deficiência enzimática específica (envolvida na sintese-anabolismo, ou na degradação- catabolismo de uma substância), uma deficiencia nos transpotadores de proteínas ou de cofatores que afecta uma determinada via metabólica, levando à acumulação de substratos, muitas vezes tóxicos, e à produção diminuída ou nula de um produto biologicamente importante. O défice enzimático é a consequência da existência de mutações num ou vários genes codificantes de proteínas importantes para o passo metabólico em causa. O diagnóstico laboratorial de uma DHM pode portanto ser efectuado a vários níveis, nomeadamente por análise bioquímica de substratos e metabolitos, enzimática e/ou molecular. As DHM individualmente são doenças raras, sendo o diagnóstico bioquímico destas patologias por vezes difícil. Nestes casos o estudo molecular é particularmente útil para a confirmação do diagnóstico e para uma eventual correlação genótipo/fenótipo. Este estudo é também importante para aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal. Estão identificados mais de 700 EIM e o seu número aumenta continuamente. Na nossa unidade são 88 as DHM estudadas molecularmente, incluídas nos 3 grupos da classificação dos EIM (defeito da síntese ou degradação de moléculas complexas, defeito do metabolismo intermediário e defeito na produção ou utilização de energia)

A síndrome de Smith-Lemli-Opitz: características fenotípicas e genotípicas dos doentes portugueses

A síndrome de Smith-Lemli-Opitz (SLOS) é uma síndrome polimalformativa de transmissão autossómica recessiva causada por um défice metabólico da biossíntese do colesterol, que se caracteriza por dismorfias craniofaciais, anomalias congénitas de vários órgãos (salientando-se as do esqueleto e do aparelho urogenital), restrição de crescimento intra-uterino (RCIU), alterações comportamentais e atraso mental. É causada por mutações no gene DHCR7, que codifica para a enzima 7-dehidrocolesterol reductase, responsável pelo último passo da via metabólica da síntese do colesterol. A SLOS caracteriza-se por níveis diminuídos de colesterol e concentrações altas do seu precursor, 7-dehidrocolesterol, no sangue e tecidos.Procedeu-se a uma análise comparativa dos fenótipo e genótipo de quinze casos de SLOS de origem portuguesa, e são tecidas considerações quanto às dificuldades e limitações inerentes ao diagnóstico, e ao facto de esta doença hereditária do metabolismo dever ser considerada no diagnóstico diferencial das situações de (i) hipocolesterolémia, (ii) RCIU e (iii) síndromes polimalformativas, (especialmente quando crianças com atraso de crescimento apresentam simultaneamente sindactilia do segundo e terceiro dedos do pé e microcefalia e/ou narinas antevertidas entre outras anomalias)