Protein foszfatázok szabályozása kölcsönható fehérjékkel = Regulation of protein phosphatases by protein-protein interactions

A pályázatban a miozin foszfatáz foszforilációval történő szabályozását és az enzim fehérje-fehérje kölcsönhatásait tanulmányoztuk. A holoenzimben protein foszfatáz-1 katalitikus alegység (PP1c) kapcsolódik a miozinhoz is kötődő szabályozó alegységhez (MYPT). A MYPT Rho-kináz általi foszforilációja gátolta a miozin foszfatáz aktivitását és simaizom kontrakciót indukált alacsony Ca2+-koncentrációnál. Ez a gátló foszforiláció nem-izom sejtek esetén stressz-rostok képződését és a sejtek migrációjának gátlását eredményezte. A MYPT protein kináz G általi foszforilációja viszont csökkentette a gátló foszforiláció mértékét, elősegítve ezzel a simaizom relaxációt. A miozin foszfatáz nem-izom sejtekben számos, a kontraktilitástól eltérő sejtfolyamatot is szabályozhat. Erre a PP1c és a MYPT neuronális, sejtmag és mitokondriális fehérjékkel történő kölcsönhatásából következtettünk. A miozin foszfatáz változatos lokalizációja és kölcsönhatásai az idegrendszerben a neurotranszmissziót szabályozó szerepét sejteti. Jellemeztük egy új, elsősorban idegszövetben előforduló fehérje foszforilációját és kimutattuk miozin foszfatázt gátló képességét. Az enzimnek a retinoblasztóma fehérje defoszforilációjában játszott szerepe pedig arra utal, hogy a miozin foszfatáz a sejtciklust is szabályozhatja. További kutatásaink olyan molekulák azonosítására irányulnak, amelyek az enzim szelektív gátlásával/aktiválásával elősegíthetik sejtfolyamatokat szabályozó szerepének mélyebb megértését. | In this project the regulation of myosin phosphatase by phosphorylation and by protein-protein interactions were studied. The holoenzyme is composed of protein phosphatase-1 catalytic subunit (PP1c) and myosin-binding regulatory subunit (MYPT). Phosphorylation of MYPT by Rho-kinase resulted in the inhibition of the activity of myosin phosphatase and induced smooth muscle contraction at low Ca2+-concentration. In non-muscle cells this inhibitory phosphorylation increased stress-fiber formation and supressed cell migration. Phosphorylation of MYPT by protein kinase G decreased the extent of inhibitory phosphorylation and resulted in smooth muscle relaxation. In non-muscle cells the myosin phosphatase may regulate cellular events distinct from the contractile processes suggested by the interaction of PP1c and MYPT with neuronal, nuclear and mitochondrial proteins. The widespread localization of myosin phosphatase in neuronal cells implicates this enzyme in the regulation of neuronal transmission. We characterized the phosphorylation and myosin phosphatase inhibitory potency of a novel protein which is mainly enriched in neuronal tissue. The myosin phosphatase dephosphorylate also the retinoblastoma protein implying its regulatory role in the cell cycle. Our further studies aim to identify molecules able to inhibit/activate the myosin phosphatase selectively; therefore they may help to clarify the regulatory role of this enzyme in the various cellular processes

A miozin foszfatáz új szabályozó funkciói nem-izom sejtekben = Novel regulatory functions of myosin phosphatase in non-muscle cells

A protein foszfatáz-1 katalitikus alegységet (PP1c) és a PP1c-t „célra irányító” regulátor alegységet (MYPT1) tartalmazó miozin foszfatáz (MP) szerepét tanulmányoztuk nem-izom sejtek sejtfolyamataiban. PP1c specifikus inhibitorok alkalmazásával, valamint a MYPT1-el kölcsönható új fehérje partnerek azonosításával kívántuk feltárni a MP új funkciót. Tanulmányoztuk a MYPT-családba tartozó TIMAP fehérje és a PP1c kölcsönhatását is és kimutattuk a PP1c-TIMAP komplex szabályozó szerepét a moezin defoszforilációjában. Felismertük, hogy tanninokban és zöld teában előforduló polifenolok PP1c szelektív inhibitorok és csökkentik a daganatos sejtek életképességét. A MYPT1-el kölcsönható fehérjeként és/vagy a MP lehetséges szubsztrátjaiként azonosítottuk a retinoblasztóma fehérjét (Rb), a nitrogén-monoxid szintetázt (NOS) és preszinaptikus neuronális fehérjéket (szinapszin, szintaxin, SNAP-25, CaM-kináz-II, kalcineurin). Kimutattuk, hogy a Rb MP által történő defoszforilációja a leukémiás sejtek kemoszenzitivitásának, a neuronális fehérjék (szintaxin, szinapszin) Rho-kináz/MP által történő foszforilációja/defoszforilációja pedig a neurotranszmitter felszabadulás fontos szabályozó folyamatai. Jellemeztük a MYPT1 és a kalcineurin kölcsönhatását és kimutattuk, hogy a MYPT1 kalcineurin által történő defoszforilációja az endotél sejtek „barrier” funkcióját szabályozza. Összefoglalva: a MP új szabályozó funkcióinak felismerése bővíti e sejtfolyamatok farmakológiai befolyásolásának lehetőségeit. | We studied the role of myosin phosphatase (MP) composed of protein phosphatase-1 catalytic subunit and PP1c-targeting regulatory subunit (MYPT1) in cellular processes of non-muscle cells. We wished to uncover novel functions of MP by using PP1c specific inhibitors as well as by identification of novel MYPT1-interacting proteins. The interaction of TIMAP, a MYPT-family protein, with PP1c was also studied and it was shown that the PP1c-TIMAP complex controlled the dephosphorylation of moesin. We identified the polyphenols of tannins and green tea as PP1c selective inhibitors which were implicated in decreasing the viability of malignant cells. The retinoblastoma protein (Rb), the nitrogen-monoxide (NO) synthase (NOS) and presynaptic neuronal proteins (synapsin, syntaxin, CaM-kinase-II,) were identified as MYPT1-interacting proteins and/or possible substrates for MP. We proved that the dephosphorylation of Rb by MP influenced chemosensitivity of leukemic cells, while the phosphorylation/dephosphorylation of neuronal proteins (synapsin, syntaxin) by Rho-kinase/MP had important regulatory roles in the neurotransmitter release. We characterized the interaction of MYPT1 with calcineurin and showed that dephosphorylation of MYPT1 by calcineurin mediated the barrier function of endothelial cells. In summary, the novel regulatory functions of MP recognized here extend the possibilities to pharmacologically influence the above cellular processes

Inhibition of protein phosphatase-1 and -2A by ellagitannins: structure-inhibitory potency relationships and influences on cellular systems

L

Interplay of myosin phosphatase and protein phosphatase-2A in the regulation of endothelial nitric-oxide synthase phosphorylation and nitric oxide production

L

The Short-Chain Fatty Acid Propionate Inhibits Adipogenic Differentiation of Human Chorion-Derived Mesenchymal Stem Cells Through the Free Fatty Acid Receptor 2

K

Inhibition of protein phosphatase-1 and -2A by ellagitannins: structure-inhibitory potency relationships and influences on cellular systems

L

Localization and Regulation of Myosin Phosphatase in Non-Muscle Cells

Angol nyelvű összefoglalássalA miozin foszfatáz (MP) holoenzim protein foszfatáz-1 (PP1) katalitikus alegységből (PP1c és 130/133 kDa miozin kötő (célra irányító) alegységből (MYPT1) áll. Elsődleges funkciója a miozin-II 20 kDa könnyűláncának (MLC20) defoszforilációja, és ezzel fontos szerepet játszik a simaizom és nem-izom sejtek kontrakciójának és motilitásának szabályozásában. A MP aktivitását a MYPT1 Thr695 és Thr850 oldalláncának Rho-asszociált kináz (ROK) általi foszforilációja szabályozza. A MP a miozinon kívül más fehérjéket is defoszforilál, azonban lokalizációja, valamint a kontraktilitáson kívül más sejtfolyamatokban játszott szabályozó szerepe nem-izom sejtekben és szövetekben kevésbé ismert. Eredményeink szerint a MP és a MYPT1 jelen van agyszövetben és humán hepatokarcinóma sejtekben (HepG2) is. Az MP aktivitása és a MYPT1 mennyisége hasonló régió- és szubcelluláris megoszlást mutat, amely a MYPT1 célra irányító funkciójára utal az idegsejtekben és a HepG2 sejtekben is. A MP és a MYPT1 az agyban valamennyi agyrégióban kimutatható, de koncentrálódása specifikus magcsoportopkhoz az idegsejtekre specifikus fiziológiai funkciókat sejtet. A MP-t kimutattuk az agykéregből izolált szinaptoszómák preszinaptikus frakciójában, és igazoltuk kölcsönhatását a szinaptofizin fehérjével, ROK-kal és a PP1cδ izoformával. A MP tehát szerepet játszhat a szinapszisok vezikuláris transzportjában és a neurotranszmitterek kibocsátásában a szinaptikus résbe. A HepG2 sejtek kezelése foszfatázinhibitor okadainsavval (OA) a protein foszfatáz 2A (PP2A) enzim gátlását eredményezve szabályozza az MLC20 és a MYPT1 foszforilációs szintjét. Az OA a MYPT1 citoplazmából plazmamembránba történő transzlokálcióját okozta és növelte a MYPT1 foszforilációját a gátló Thr695 oldalláncon. Ezen hatásokat a ROK inhibitor Y27632 kevésbé befolyásolta. Az OA növelte a MYPT1 foszforilációját a Thr850 oldalláncon (MYPT1pThr850), amelyet Y27632 nagymértékben gátolt. A MYPT1pThr850 a sejtmagban és a perinukleáris régióban volt jelen. Az OA kezelés a MLC20 Ser19 foszforilációját és a foszforilált miozin-II-nek a sejtek centrális részén való koncentrálódását indukálta, amelyet az Y27632 részlegesen gátolt. HepG2 sejtekben az OA hatására stresszrostok képződtek és csökkent a sejtek migrációs készsége, de e változások a ROK inhibitor jelenlétében nem figyelhetők meg. Következtetésünk az, hogy az OA PP2A- és részben ROK-függő módon a MYPT1 szelektív foszforilációját és transzlokációját indukálja, ami a miozin defoszforilációjának gátlásával párosul. Ezek a hatások a miozin fenntartott foszforilációját eredményezve szabályozzák a sejtek motilis sajátságait.Egyetemi doktori (PhD) értekezés ; Debrecen, Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Vegytani Intézet, 2005PhDBibliogr.: p. 70-8