Variabilidade dos exons 2 e 4 do gene BCHE e sua relaçao com a atividade da butirilcolinesterase

Orientadora : Eleidi A. Chautard-Freire-MaiaCo-orientador : Ricardo L.R. de SouzaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Genética. Defesa: Curitiba, 2005Inclui bibliografiaA butirilcolinesterase (BChE) é uma enzima sérica produzida no fígado e adipócitos, sendo amplamente distribuída no organismo. É codificada pelo gene BCHE, onde mais de 50 alelos foram identificados, além do alelo mais freqüente: usual ou selvagem. Nesse estudo foram detectadas variantes do gene BCHE e determinadas suas freqüências, em amostras de doadores de sangue da população de Curitiba. A fim de priorizar o efeito das variantes desse gene sobre a atividade da BChE, algumas variáveis, que também exercem efeito sobre a atividade, foram tornadas constantes ou tiveram sua variância minimizada. Assim, consideraram-se apenas homens euro-brasileiros, de fenótipo CHE2 C5-, com faixa etária entre 18 e 30 anos e 20 = IMC = 25. Dos 570 indivíduos analisados quanto à atividade enzimática, foram separados 370, pertencentes a três grupos de atividade (baixa, média e alta), para serem examinados quanto à variação do DNA. As seqüências codificadoras dos exons 2 e 4 foram amplificadas e analisadas pela técnica de SSCA. Foram encontrados 12 tipos diferentes de variantes (11 no exon 2 e 1 no exon 4) em 127 das 370 amostras, sendo que 20 das 127 amostras apresentaram A539T do exon 4 (segunda variante mais freqüente) e uma outra mutação no exon 2. A variante A539T foi encontrada com uma freqüência total de 17,49% ± 1,40%, sendo mais freqüente no grupo de atividade baixa (32,63% ± 3,05%). A maioria das mutações no exon 2 também está concentrada no grupo de atividade baixa. A terceira mutação mais freqüente foi a D70G (1,80% ± 0,49%), seguida de E255D (0,98% ± 0,37%), A184V (0,70% ± 0,31%), T243M (0,28% ± 0,19%) e G390V (0,28% ± 0,19%). As outras variantes não sinônimas apareceram apenas em um heterozigoto cada (K12R, V294M, G333C e R470W), com freqüência alélica de 0,14% ± 0,14%. Além dessas variantes, foram encontradas duas mutações sinônimas, uma no grupo de atividade baixa (A162A; 0,14% ± 0,14%) e outra no de atividade média (G15G; 0,14% ± 0,14%). Cinco dessas mutações, K12R, G15G, V294M, G333C e R470W, ainda não tinham sido descritas. Plasmídeos contendo insertos com as quatro novas mutações não sinônimas, e três mutações (G75R, E90D e I99M) descritas por SOUZA et al. (no prelo) foram expressos em células 293T para determinar a atividade da BChE. Apenas a variante E90D condiciona fenótipo silencioso; as mutações G75R e G333C condicionam BChE com atividade de, respectivamente, 45% e 20% da atividade da enzima usual; as outras 4 mutações determinam BChE de atividade normal. O fato de muitas mutações causarem efeitos na estrutura e na expressão da BChE, podendo ser responsáveis pela diminuição na atividade enzimática, explica a maior proporção dos genótipos não usuais no grupo de atividade baixa, representando 79% dos encontrados no exon 2 e 56% dos encontrados no exon 4Butyrylcholinesterase (BChE) is a serum enzyme synthesized in the liver and adipose cells and it is widely distributed in the body. It is coded by the BCHE gene where more than 50 alleles had been identified, besides the most frequent allele: the usual or wild type. In this study BCHE gene variants were detected and their frequencies were determined in samples from blood donors of the Curitiba population. In order to give priority to the effect of gene variants on BChE activity, some variables which also affect this activity were set as constants or had their variance minimized. Thus, the subjects were only Euro-Brazilian males of the CHE2 C5- phenotype, aged from 18 to 30 years and with 20 = BMI = 25. Plasmas from the 570 subjects were tested for BChE activity and 370 of them classified into 3 activity groups (low, mean and high) were examined for DNA variation. Exons 2 and 4 of the coding sequence of the BCHE gene were amplified and analyzed by SSCA. Twelve different types of variants were found (11 in exon 2 and 1 in exon 4) in 127 out of 370 samples of which 20 samples presented the A539T variant in exon 4 (second more frequent variant) and another variant in exon 2 simultaneously. The A539T variant was found with a total frequency of 17.49% ± 1.40%, being more frequent in the low BChE activity group (32.63% ± 3.05%). Mostly of exon 2 mutations were found in the low activity group. The third more frequent variant was D70G (1.80% ± 0.49%), followed by E255D (0.98% ± 0.37%), A184V (0.70% ± 0.31%), T243M (0.28% ± 0.19%) and G390V (0.28% ± 0.19%). The other non synonymous variants were found only once in one heterozygote (K12R, G15G, V294M, G333C and R470W), with an allelic frequency of 0.14% ± 0.14%. Besides these, two synonymous mutations were found, one in the low activity group (A162A; 0.14% ± 0.14%) and another in the mean activity group (G15G; 0.14% ± 0.14%). Five of these mutations, K12R, G15G, V294M, G333C and R470W had not been previously reported. Plasmids containing the inserts with these 4 new non synonymous mutations and 3 mutations (G75R, E90D and I99M) described by SOUZA et al. (in press) were expressed in 293T cells in order to determine BChE activity. Only the E90D variant determines a silent phenotype; the G75R and G333C mutations are responsible for enzymes with BChE activity of about 45% and 20% of the wild type enzyme, respectively; the other 4 mutations determine BChE with normal activity. The fact that many mutations cause effects in BChE structure and expression, and may lead to decreased enzyme activity, explains the higher non usual genotype proportion in the low activity group, representing 79% of these genotypes found in exon 2 and 56% of these genotypes found in exon 4

Variabilidade dos exons 2 e 4 do gene BCHE e sua relaçao com a atividade da butirilcolinesterase

Orientadora : Eleidi A. Chautard-Freire-MaiaCo-orientador : Ricardo L.R. de SouzaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Genética. Defesa: Curitiba, 2005Inclui bibliografiaA butirilcolinesterase (BChE) é uma enzima sérica produzida no fígado e adipócitos, sendo amplamente distribuída no organismo. É codificada pelo gene BCHE, onde mais de 50 alelos foram identificados, além do alelo mais freqüente: usual ou selvagem. Nesse estudo foram detectadas variantes do gene BCHE e determinadas suas freqüências, em amostras de doadores de sangue da população de Curitiba. A fim de priorizar o efeito das variantes desse gene sobre a atividade da BChE, algumas variáveis, que também exercem efeito sobre a atividade, foram tornadas constantes ou tiveram sua variância minimizada. Assim, consideraram-se apenas homens euro-brasileiros, de fenótipo CHE2 C5-, com faixa etária entre 18 e 30 anos e 20 = IMC = 25. Dos 570 indivíduos analisados quanto à atividade enzimática, foram separados 370, pertencentes a três grupos de atividade (baixa, média e alta), para serem examinados quanto à variação do DNA. As seqüências codificadoras dos exons 2 e 4 foram amplificadas e analisadas pela técnica de SSCA. Foram encontrados 12 tipos diferentes de variantes (11 no exon 2 e 1 no exon 4) em 127 das 370 amostras, sendo que 20 das 127 amostras apresentaram A539T do exon 4 (segunda variante mais freqüente) e uma outra mutação no exon 2. A variante A539T foi encontrada com uma freqüência total de 17,49% ± 1,40%, sendo mais freqüente no grupo de atividade baixa (32,63% ± 3,05%). A maioria das mutações no exon 2 também está concentrada no grupo de atividade baixa. A terceira mutação mais freqüente foi a D70G (1,80% ± 0,49%), seguida de E255D (0,98% ± 0,37%), A184V (0,70% ± 0,31%), T243M (0,28% ± 0,19%) e G390V (0,28% ± 0,19%). As outras variantes não sinônimas apareceram apenas em um heterozigoto cada (K12R, V294M, G333C e R470W), com freqüência alélica de 0,14% ± 0,14%. Além dessas variantes, foram encontradas duas mutações sinônimas, uma no grupo de atividade baixa (A162A; 0,14% ± 0,14%) e outra no de atividade média (G15G; 0,14% ± 0,14%). Cinco dessas mutações, K12R, G15G, V294M, G333C e R470W, ainda não tinham sido descritas. Plasmídeos contendo insertos com as quatro novas mutações não sinônimas, e três mutações (G75R, E90D e I99M) descritas por SOUZA et al. (no prelo) foram expressos em células 293T para determinar a atividade da BChE. Apenas a variante E90D condiciona fenótipo silencioso; as mutações G75R e G333C condicionam BChE com atividade de, respectivamente, 45% e 20% da atividade da enzima usual; as outras 4 mutações determinam BChE de atividade normal. O fato de muitas mutações causarem efeitos na estrutura e na expressão da BChE, podendo ser responsáveis pela diminuição na atividade enzimática, explica a maior proporção dos genótipos não usuais no grupo de atividade baixa, representando 79% dos encontrados no exon 2 e 56% dos encontrados no exon 4Butyrylcholinesterase (BChE) is a serum enzyme synthesized in the liver and adipose cells and it is widely distributed in the body. It is coded by the BCHE gene where more than 50 alleles had been identified, besides the most frequent allele: the usual or wild type. In this study BCHE gene variants were detected and their frequencies were determined in samples from blood donors of the Curitiba population. In order to give priority to the effect of gene variants on BChE activity, some variables which also affect this activity were set as constants or had their variance minimized. Thus, the subjects were only Euro-Brazilian males of the CHE2 C5- phenotype, aged from 18 to 30 years and with 20 = BMI = 25. Plasmas from the 570 subjects were tested for BChE activity and 370 of them classified into 3 activity groups (low, mean and high) were examined for DNA variation. Exons 2 and 4 of the coding sequence of the BCHE gene were amplified and analyzed by SSCA. Twelve different types of variants were found (11 in exon 2 and 1 in exon 4) in 127 out of 370 samples of which 20 samples presented the A539T variant in exon 4 (second more frequent variant) and another variant in exon 2 simultaneously. The A539T variant was found with a total frequency of 17.49% ± 1.40%, being more frequent in the low BChE activity group (32.63% ± 3.05%). Mostly of exon 2 mutations were found in the low activity group. The third more frequent variant was D70G (1.80% ± 0.49%), followed by E255D (0.98% ± 0.37%), A184V (0.70% ± 0.31%), T243M (0.28% ± 0.19%) and G390V (0.28% ± 0.19%). The other non synonymous variants were found only once in one heterozygote (K12R, G15G, V294M, G333C and R470W), with an allelic frequency of 0.14% ± 0.14%. Besides these, two synonymous mutations were found, one in the low activity group (A162A; 0.14% ± 0.14%) and another in the mean activity group (G15G; 0.14% ± 0.14%). Five of these mutations, K12R, G15G, V294M, G333C and R470W had not been previously reported. Plasmids containing the inserts with these 4 new non synonymous mutations and 3 mutations (G75R, E90D and I99M) described by SOUZA et al. (in press) were expressed in 293T cells in order to determine BChE activity. Only the E90D variant determines a silent phenotype; the G75R and G333C mutations are responsible for enzymes with BChE activity of about 45% and 20% of the wild type enzyme, respectively; the other 4 mutations determine BChE with normal activity. The fact that many mutations cause effects in BChE structure and expression, and may lead to decreased enzyme activity, explains the higher non usual genotype proportion in the low activity group, representing 79% of these genotypes found in exon 2 and 56% of these genotypes found in exon 4

Nuclear halo from Bradysia hygida (Diptera:Sciaridae) salivary gland polytene cells

A protocol for recovered nuclear halos from insect polytene nuclei after the extraction of the nuclear proteins using LIS detergent is reported in this work. Analysis was carried out using fluorescence and confocal laser scan microscopy. The extraction of nuclear halos was possible only with nuclei-fraction isolation in hypotonic buffer without spermine and spermidine. The recovered nuclear halos from Bradysia hygida salivary gland polytene nuclei, contributed greatly to the study of the structure and function of these special organelles

Multiple copy number variation in a patient with Kleefstra syndrome

ABSTRACT Objective: To report a rare case of a patient with a molecular diagnosis of Kleefstra syndrome (KS) who has four other chromosomal alterations involving pathogenic variants. Case description: Male patient, two years old, with global delay, including in neuropsychomotor development, ocular hypertelorism, broad forehead, brachycephaly, hypotonia, ligament laxity, unilateral single palmar crease and arachnoid cyst. The microarray-based comparative genomic hybridization (a-CGH) identified copy number variations (CNVs) in five regions: 9q34.3, 6p22.1, Yq11.223, Yp11.23, and 2q24.1. The heterozygous microdeletion in 9q34.3 involving the EHMT1 gene confirms the diagnosis of KS. Comments: The presence of pathogenic CNVs and/or those of uncertain significance, located on chromosomes 2, 6 and Y, may be contributing to a variability in the patient's clinical condition (arachnoid cyst, single palmar fold and ligament laxity), compared to other individuals with only KS genetic alteration, making the dignosis of the disease harder