Bottom-up reconstitution using giant unilamellar vesicles as membrane compartments

One of the most basic defining features of a living biological cell is its ability to confine its molecular components within an isolating boundary. In all living cells known to date, phospholipid membranes play this central role by separating cellular machinery from the outside environment. Compartmentalization by membranes is a key principle of life, not only on the scale of the cell as a whole, but, in many cases, within cells as well. This unification and isolation of essential processes within a single, definable unit has made life as we know it possible. As such, compartmentalization represents an essential task that had to be achieved in the emergence of life, as only a confining barrier to the environment allows for distinction of individual units of life and therefore for Darwinian evolution. Another core task of life, is the ability to reproduce. Modern cells are able to split into two daughter cells by deforming their compartmentalizing membrane barrier, all with a division machinery which is situated within this barrier itself – a quite remarkable feat. In this thesis, I present my doctoral work, which aimed to investigate these key features of life through bottom-up reconstitution approaches. Bottom-up cell biology uses isolated well-characterized components, like purified proteins, and tries to recreate cellular processes from these simple building blocks. One of the core challenges of classical cell biology is how to tackle the intrinsic complexity of biological systems with an analytical approach. Complexity is one of the most intrinsic features of life on earth, owing to billions of years of evolution. Biological cells are not designed to be understood and in fact, complexity itself contributes to the adaptability and robustness of biological function. However, by reconstitution of biological structure and function from the bottom-up with minimal components, scientists can observe and try to understand the emergence of biological complexity. Membranes, of course, play a great role in many cellular processes, and contribute significantly to this complexity. However, they can be difficult to incorporate into bottom-up reconstitution approaches, limiting our ability to get a complete view of such processes from in vitro experiments. In this thesis, I present a number of projects, which use giant unilamellar vesicles (GUVs) as mimicries of the compartmentalizing membranes of cells to investigate basic biological functions. I’ve encapsulated a diverse array of biological components in GUVs to achieve biomimetic behavior and function. In each case, I made use of the unique properties of the GUVs to achieve behaviors or make observations that would have not been possible with other approaches, including alternative model membrane systems. Overall, my work presents a step forward toward the reconstitution of complex and dynamic cellular processes under cell-like conditions.Eines der grundlegendsten Definitionsmerkmale einer lebenden biologischen Zelle ist ihre Fähigkeit, ihre molekularen Komponenten innerhalb einer isolierenden Barriere einzuschließen. In allen bis dato bekannten lebenden Zellen spielen Phospholipidmembranen diese zentrale Rolle, indem sie die zelluläre Maschinerie von der äußeren Umgebung abtrennen. Die Kompartmentalisierung durch Membranen ist ein Schlüsselprinzip des Lebens, nicht nur auf der Ebene der kompletten Zelle, sondern oft auch innerhalb von Zellen. Diese Einschließung und Isolierung wesentlicher Prozesse innerhalb einer einzigen, definierbaren Einheit hat Leben, wie wir es kennen, möglich gemacht. Damit stellt die Kompartimentierung eine wesentliche Aufgabe dar, die bei der Entstehung des Lebens realisiert werden musste, denn nur eine abgrenzende Barriere zur Umwelt ermöglicht die Unterscheidung einzelner Lebenseinheiten und damit die darwinistische Evolution. Eine weitere Kernaufgabe des Lebens, ist die Fähigkeit zur Vermehrung. Moderne Zellen sind in der Lage, sich durch Verformung ihrer kompartimentierenden Membranbarriere in zwei Tochterzellen zu teilen, und zwar mit einer Teilungsmaschinerie, die sich innerhalb dieser Barriere befindet - eine bemerkenswerte Leistung. In dieser Dissertation stelle ich meine Forschungsergebnisse vor, deren Ziel es war, diese Schlüsselmerkmale des Lebens durch Bottom-up-Rekonstruktionsansätze zu untersuchen. Die Bottom-up-Zellbiologie verwendet isolierte, gut charakterisierte Komponenten, wie gereinigte Proteine, und versucht, zelluläre Prozesse aus diesen einfachen Bausteinen zu rekonstruieren. Eine der Kernherausforderungen der klassischen Zellbiologie ist, wie man die intrinsische Komplexität biologischer Systeme mit einem analytischen Ansatz angehen kann. Komplexität ist eines der intrinsischen Merkmale des Lebens auf der Erde, das auf Milliarden von Jahren der Evolution zurückzuführen ist. Biologische Zellen sind nicht darauf ausgelegt, verstanden zu werden, und vielmehr trägt Komplexität zur Anpassungsfähigkeit und Robustheit biologischer Funktionsweisen bei. Durch die Rekonstruktion von biologischen Strukturen und Funktionen mit minimalen Komponenten können Wissenschaftler jedoch die Entstehung biologischer Komplexität beobachten und zu verstehen versuchen. Membranen spielen eine große Rolle in vielen zellulären Prozessen und tragen wesentlich zu dieser Komplexität bei. Sie können allerdings schwer in Bottom-up- Rekonstitutionsansätze zu integrieren sein, was die Möglichkeiten einschränken kann, einen vollständigen Blick auf solche Prozesse durch in vitro-Experimenten zu erhalten. In dieser Arbeit stelle ich eine Reihe von Projekten vor, die riesige unilamellare Vesikel (GUVs) als Nachahmung der kompartimentierenden Membranen von Zellen verwenden, um dabei grundlegende biologische Funktionen zu untersuchen. Dafür habe ich eine Vielzahl von biologischen Komponenten in GUVs eingekapselt, um biomimetisches Verhalten und Funktion zu erzielen. Dabei habe ich jeweils die einzigartigen Eigenschaften der GUVs genutzt, um Verhaltensweisen zu erreichen oder Beobachtungen zu machen, die mit anderen Ansätzen, einschließlich alternativer Modellmembransystemen, nicht möglich gewesen wären. Insgesamt stellt meine Arbeit einen Schritt vorwärts in Richtung der Rekonstruktion komplexer und dynamischer zellulärer Prozesse unter zellähnlichen Bedingungen dar

Konzeption und Durchführung eines Stakeholder-Involvements in BiKF (am Beispiel der ersten Phase von "Wald- und Forstsysteme der Zukunft")

Im folgenden Paper wird die Konzeption des Stakeholder-Involvements für das BiKF-Projekt "Wald- und Forstsysteme der Zukunft" zusammenfassend dargestellt. In Zeiten der Diskussion um Art und Ausmaß der Klimaerwärmung ist es auch in der Forstwirtschaft an der Zeit, sich auf mögliche neue Verhältnisse einzustellen. Dies betrifft vor allem das waldbauliche Vorgehen. Je nach Intensität des Klimawandels müssen neue Konzepte entwickelt werden. Das Projekt hat sich zum Ziel gesetzt, zusammen mit Stakeholdern (Anspruchsgruppen) des Waldes naturwissenschaftliche Szenarien zu bewerten und daraus Handlungsempfehlungen abzuleiten. Ausgehend von dieser Forschungsfrage wurde in der ersten Phase dieses Projektes ein Stakeholder-Workshop (WS) durchgeführt. Bei diesem Workshop sollten Themenfelder und aufbauend auf einem Impulsreferat weiterführende Diskussionsfelder erarbeitet werden. Der Auswahl der Stakeholder ging eine Diskursfeldanalyse voraus, aus der eine vorläufige Liste möglicher Anspruchsgruppen abgeleitet wurde. Eine hessenbezogene Auswahl von Repräsentanten dieser Stakeholder wurde über das Forschungsvorhaben informiert und eingeladen. Die meisten der Eingeladenen kamen zum Workshop am 2. Februar 2010. Verschiedene Referate zu den Themen Baumartenwahl und Entscheiden unter Unsicherheit wurden gehalten und das erarbeitete Szenario vorgestellt. Darüber hinaus wurden zwei moderierte Arbeitsgruppen zu verschiedenen Aspekten des Szenarios eingerichtet und Platz für Diskussionen vorgesehen. ...This paper summarizes the conception of the stakeholders' involvement in the first stage of the project BiKF "Forest and forestry systems of the future". In times of climate change forestry faces new conditions and challenges. This applies especially to silvicultural methods. Depending on the intensity of climate change new concepts have to be developed. The project’s goal was set to discuss and to rate scientific scenarios and to derive recommendations of action in co-operation with stakeholder groups of forestry and forest research. With regard to this objective, a stakeholder workshop was held in the project’s first stage to establish issues and topics of dis-cussion. Potential stakeholders were chosen based on a discourse field analysis. A selection was informed on the project’s endeavour and was invited to the workshop. Most of the invited came to the workshop on 2nd February 2010 in Frankfurt/Main. At the workshop three speakers gave talks on the central topics "Deciding in times of uncertainty" and "Choosing tree species for climate change" and presented the scenario on the effects of Mediterranean oaks in Central European forests. Furthermore, two working groups on different topics have been set up and room for plenum discussions was given. Evaluating the workshop, some important insights for the conception of the stakeholders' involvement and the organisation of future stakeholder workshops have been gained. The different behaviour of participants during the discussion allowed deriving four hypotheses which will be tested in the future. In addition, some recommendations for issues and contents can be made. Also some flaws in planning and preparation became obvious

Bildungsberatung für Arbeitsuchende und Kooperation mit dem AMS: Betrachtungen zu Angeboten und Kooperationen. Ergebnisse einer aktuellen Studie im Auftrag des AMS Österreich

[Einleitung] Qualifizierung stellt für Arbeitsuchende eine wichtige Voraussetzung für die Verbesserung ihrer Erwerbschancen und die Vermittlung in neue Beschäftigungsverhältnisse dar. Dazu bedarf es des flächendeckenden Angebotes einer fachkundigen Bildungsberatung. Diese kann vom Arbeitsmarktservice (AMS) im Rahmen seines Leistungsspektrums und der dafür zur Verfügung stehenden Ressourcen selbst nur tlw. bereitgestellt werden. Daher ist es notwendig, auf anbieterneutrale Beratungsleistungen anderer Einrichtungen zurückzugreifen. In den einzelnen Bundesländern sind die Trägereinrichtungen von Bildungsberatungsangeboten in unterschiedlichem Ausmaß untereinander und mit dem AMS vernetzt. Ziel der vorliegenden Studie im Auftrag der Abt. Arbeitsmarktforschung und Berufsinformation des AMS Österreich war daher eine Bestandsaufnahme von Bildungsberatungsangeboten für Arbeitsuchende in den einzelnen Bundesländern. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf bereits vorhandene bzw. angedachte Kooperationen mit Landesgeschäftsstellen und Regionalen Geschäftsstellen (RGS) des AMS bzw. mit den BerufsInfoZentren (BIZ) des AMS gelegt. Im Rahmen der Studie sollten mögliche inhaltliche und regionale Lücken im Bildungsberatungsangebot aufgezeigt und Hinweise und Empfehlungen für (Weiter-)Entwicklungen von Netzwerkaktivitäten und Kooperationsmöglichkeiten erarbeitet werden

Meta-Analyse zu rezenten Studien im Bereich "AMP-Maßnahmen für Jugendliche": Betrachtungen mit dem Schwerpunkt "Berufsausbildung"

Jugendliche stellen seit Jahren eine wesentliche Zielgruppe der österreichischen Arbeitsmarktpolitik dar. Denn die Bekämpfung von Jugendarbeitslosigkeit und die Verhinderung des Ausstieges aus dem Ausbildungs- bzw. Beschäftigungssystem helfen dabei, nachhaltige individuelle und volkswirtschaftliche Folgekosten zu vermeiden. Auch im Regierungsprogramm 2013 bis 2018 sind ausdrücklich die Aufwertung der Lehrausbildung und die Implementation einer Ausbildungspflicht für Jugendliche bis 18 Jahre festgehalten. Vor diesem Hintergrund hat das AMS Österreich, Abteilung Arbeitsmarkt- und Berufsinformation (ABI), das Österreichische Institut für Berufsbildungsforschung mit der Durchführung einer Analyse der aktiven Arbeitsmarktpolitik für Jugendliche auf der Grundlage von rezenten Studien beauftragt. Die Ergebnisse dieser im Jahr 2014 realisierten Studie liegen nunmehr in Form des AMS report 109 vor. Wir hoffen, mit diesem AMS report einen Beitrag zu einer fundierten Diskussion im Hinblick auf die Gestaltung und Weiterentwicklung arbeitsmarktpolitischer Maßnahmen für Jugendliche leisten zu können. Im Besonderen möchten wir uns auch bei den TeilnehmerInnen der ExpertInnen-Diskussionen im Rahmen dieser Studie bedanken, die durch ihren engagierten Input dem Projektteam wesentliche inhaltliche Anregungen vermitteln konnten

Shaping Giant Membrane Vesicles in 3D-Printed Protein Hydrogel Cages

Giant unilamellar phospholipid vesicles are attractive starting points for constructing minimal living cells from the bottom-up. Their membranes are compatible with many physiologically functional modules and act as selective barriers, while retaining a high morphological flexibility. However, their spherical shape renders them rather inappropriate to study phenomena that are based on distinct cell shape and polarity, such as cell division. Here, a microscale device based on 3D printed protein hydrogel is introduced to induce pH-stimulated reversible shape changes in trapped vesicles without compromising their free-standing membranes. Deformations of spheres to at least twice their aspect ratio, but also toward unusual quadratic or triangular shapes can be accomplished. Mechanical force induced by the cages to phase-separated membrane vesicles can lead to spontaneous shape deformations, from the recurrent formation of dumbbells with curved necks between domains to full budding of membrane domains as separate vesicles. Moreover, shape-tunable vesicles are particularly desirable when reconstituting geometry-sensitive protein networks, such as reaction-diffusion systems. In particular, vesicle shape changes allow to switch between different modes of self-organized protein oscillations within, and thus, to influence reaction networks directly by external mechanical cues

Communication

The geometry of reaction compartments can affect the local outcome of interface-restricted reactions. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are commonly used to generate cell-sized, membrane-bound reaction compartments, which are, however, always spherical. Herein, we report the development of a microfluidic chip to trap and reversibly deform GUVs into cigar-like shapes. When trapping and elongating GUVs that contain the primary protein of the bacterial Z ring, FtsZ, we find that membrane-bound FtsZ filaments align preferentially with the short GUV axis. When GUVs are released from this confinement and membrane tension is relaxed, FtsZ reorganizes reversibly from filaments into dynamic rings that stabilize membrane protrusions; a process that allows reversible GUV deformation. We conclude that microfluidic traps are useful for manipulating both geometry and tension of GUVs, and for investigating how both affect the outcome of spatially-sensitive reactions inside them, such as that of protein self-organization.We acknowledge the MPIB Biochemistry Core Facility for assistance in protein purification

3-D-Koordinatenmessung durch optische Triangulation

Das hier vorgestellte Drei-Koordinaten-Meßgerät arbeitet nach dem Prinzip der optischen Triangulation. Einzelne Punkte einer Oberfläche können gezielt angetastet und vermessen werden. Hierbei wurden Meßunsicherheiten von ± 0,1mm bei einer maximalen Meßgeschwindigkeil von 25 Punkten/Sekunde erreicht. Bei einem Meßabstand von 420mm beläuft sich das Antastfeld auf 150 x 150mm. Der optische Aufbau ermöglicht einen Abstandsmeßbereich von ca. 350 mm. Das Gerät eignet sich zur räumlichen Vermessung nichtspiegelnder Werkstückoberflächen. Da das Meßkonzept eine freie Vorgabe der Antastpunkte gestattet, sind Toleranz- und Vollständigkeitsprüfungsaufgaben in der Serienfertigung bevorzugte Anwendungen

Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture

The proteins that make up the actin cytoskeleton can self-assemble into a variety of structures. In vitro experiments and coarse-grained simulations have shown that the actin crosslinking proteins α-actinin and fascin segregate into distinct domains in single actin bundles with a molecular size-dependent competition-based mechanism. Here, by encapsulating actin, α-actinin, and fascin in giant unilamellar vesicles (GUVs), we show that physical confinement can cause these proteins to form much more complex structures, including rings and asters at GUV peripheries and centers; the prevalence of different structures depends on GUV size. Strikingly, we found that α-actinin and fascin self-sort into separate domains in the aster structures with actin bundles whose apparent stiffness depends on the ratio of the relative concentrations of α-actinin and fascin. The observed boundary-imposed effect on protein sorting may be a general mechanism for creating emergent structures in biopolymer networks with multiple crosslinkers