P2X7 Receptor Promotes Mouse Mammary Cancer Cell Invasiveness and Tumour Progression, and Is a Target for Anticancer Treatment

The P2X7 receptor is an ATP-gated cation channel with a still ambiguous role in cancer progression, proposed to be either pro- or anti-cancerous, depending on the cancer or cell type in the tumour. Its role in mammary cancer progression is not yet defined. Here, we show that P2X7 receptor is functional in highly aggressive mammary cancer cells, and induces a change in cell morphology with fast F-actin reorganization and formation of filopodia, and promotes cancer cell invasiveness through both 2- and 3-dimensional extracellular matrices in vitro. Furthermore, P2X7 receptor sustains Cdc42 activity and the acquisition of a mesenchymal phenotype. In an immunocompetent mouse mammary cancer model, we reveal that the expression of P2X7 receptor in cancer cells, but not in the host mice, promotes tumour growth and metastasis development, which were reduced by treatment with specific P2X7 antagonists. Our results demonstrate that P2X7 receptor drives mammary tumour progression and represents a pertinent target for mammary cancer treatment

Développement de stratégies d'imagerie radioisotopique quantitative in vivo pour l'optimisation de la vectorisation de l'adénovirus CFTR dans la thérapie génique de la mucoviscidose

L'objectif de notre travail était de développer des stratégies d'imagerie radioisotopique afin d'optimiser la vectorisation d'un adénovirus CFTR administré par inhalation dans les territoires cibles du poumon, définis comme la trachée, les bronches jusqu'aux jonctions broncho-bronchiolaires (poumon central) tout en évitant les alvéoles. Pour cela, une technique de radiomarquage du vecteur viral par un isotope émetteur de rayons gamma, le Technétium 99m, a été mise au point. L'étude étant à réaliser chez le babouin, espèce la plus prédictive du dépôt pulmonaire chez l'homme, nous avons optimisé les caractéristiques physiques des aérosols afin d'obtenir une distribution principalement au niveau du poumon central. La nébulisation représentant un stress physique pour l'adénovirus qui entraîne une diminution de son potentiel de transfection, un nébuliseur permettant de respecter l'intégrité du vecteur a été sélectionné. Après l'administration de l'adénovirus radiomarqué aux animaux, son dépôt dans les différentes zones pulmonaires a été quantifié par imagerie scintigraphique. Des prélèvements au niveau du poumon ont permis de comparer la présence d'ADN viral et l'expression du gène CFTR aux prédictions de dépôt issues de l'imagerie radioisotopique. Pour l'application de cette démarche à l'homme, nous avons validé une modélisation basée sur l'utilisation d'un agent radiopharmaceutique courant, le 99mTc-DTPA. Préparé dans des conditions de formulation identiques à celles de l'adénovirus, c'est-à-dire en milieu de forte viscosité, le 99mTc-DTPA nébulisé s'avère prédictif du comportement de l'aérosol viral in vitro et in vivo. Cette approche scintigraphique constitue un nouvel outil pour le développement de nouveaux vecteurs et permettrait pour chaque malade de réaliser, préalablement à la thérapie génique, un examen visant à assurer l'efficacité et la sécurité du traitement.TOURS-BU Médecine (372612103) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

High Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology.

OBJECTIVES:We have developed a relevant preclinical model associated with a specific imaging protocol dedicated to onco-pharmacology studies in mice. MATERIALS AND METHODS:We optimized both the animal model and an ultrasound imaging procedure to follow up longitudinally the lung tumor growth in mice. Moreover we proposed to measure by photoacoustic imaging the intratumoral hypoxia, which is a crucial parameter responsible for resistance to therapies. Finally, we compared ultrasound data to x-ray micro computed tomography and volumetric measurements to validate the relevance of this approach on the NCI-H460 human orthotopic lung tumor. RESULTS:This study demonstrates the ability of ultrasound imaging to detect and monitor the in vivo orthotopic lung tumor growth by high resolution ultrasound imaging. This approach enabled us to characterize key biological parameters such as oxygenation, perfusion status and vascularization of tumors. CONCLUSION:Such an experimental approach has never been reported previously and it would provide a nonradiative tool for assessment of anticancer therapeutic efficacy in mice. Considering the absence of ultrasound propagation through the lung parenchyma, this strategy requires the implantation of tumors strictly located in the superficial posterior part of the lung

Antitumoral effects of combined non thermal plasma and gemcitabine treatments on Mia Paca-luc orthotopic pancreatic carcinoma model

International audienceCancer of the exocrine pancreas and most particularly ductal adenocarcinoma, the most common form of pancreatic cancer1, is rarely curable and has an overall survival rate of less than 4%. Moreover, chemotherapy and radiotherapy of pancreatic cancer are only, up to now, palliative treatments. New therapeutic approaches are then necessary. Recent results we obtained on the treatment of glioblastoma and colon carcinoma2,3 led us to evaluate the antitumoral effect of non-thermal plasma (NTP) alone or in combination with Gemcitabine, reference chemotherapeutic agent, in the case of pancreas cancer. Experiments were carried out using the Plasma Gun developed in GREMI both in vitro on MIA PaCa2-luc cell lines (ductal adenocarcinoma cells) and in vivo on a MIA PaCa Luc orthotopic Pancreatic carcinoma murin model (Female Swiss nude mice from Charles River Laboratoires France). As we verified with Gemcitabine, Plasma Gun NTP had an in vitro significant antitumor activity with an IC50 of 13s exposure duration. In vivo experiments were carried out using four mouse groups: one control group, one group treated only with Gemcitabine, one group treated only using the Plasma Gun, and one group treated using a combination of Gemcitabine and Plasma Gun treatment. The striking results of this series of experiments is that, not only, the plasma treatment appeared more efficient than Gemcitabine alone, but that the combination of both led to the most effective tumor growth arrest, indicating a possible synergetic effect between NTP and chemotherapeutical agent. 1. M.P. Wescott and A.K. Rustgi Cancer Prevention Research 2008;1:503-6.2. M Vandamme, E Robert, S Dozias et al, Plasma Medicine 2011;1:27-43.3. M Vandamme, E Robert, S Lerondel et al, Int J Cancer 2011________________________________* Work supported by APR Région Centre PLASMED project and CG 45

Comparison of image restoration methods for bioluminescence imaging

International audienceBioluminescence imaging is a recent modality to visualize biological effects more especially for small animals. However the acquired images are degraded by diffusion and absorption phenomena from the tissue and by the acquisition system itself. In this paper, we use restoration methods to enhance the quality of bioluminescence images. We propose a model for image formation and an experimental determination of the PSF (Point Spread Function). Several methods of restoration are compared on test images generated according to the model and on real data. This comparison is insured by using MSE (Mean Square Error) and two quantitative criteria. Results establish that the statistical methods give more accurate restoration and well adapted for Bioluminescence Imaging

Potentialities of DBD and Plasma Gun non thermal plasma sources in cancerology

International audienceOver the past few years, nonthermal atmospheric pressure plasma has emerged as a novel promising tool in medicine. In Orleans, an important project “Plasmed” dedicated to the study of therapeutic applications of plasmas in cancerology and dermato-cosmetology, gather together plasma researchers, biologists, medical doctors and partner companies. In a first step, the antitumor effect of plasma treatment has been studied on U87 glyoblastoma (brain tumor) cells in vitro and in vivo using a pulsed floating electrode DBD plasma reactor driven by an adjustable power supply. This allows plasma treatments over a wide range of parameters concerning applied voltage and discharge frequency up to one kHz. Bioluminescence (BLI), a gene expression imaging modality that is closely dependant upon metabolism and proliferation, was used to assess cell viability or tumor growth together with MTT assay and by trypan blue assay for in vitro experiments. In that case, 24-well plates were seeded with U87 cells previously transfected by the luciferase gene (U87-Luc). In vitro plasma induced a decrease of BLI resulting from a massive cell death. Already, very interesting results have been obtained in vivo, showing plasma antitumor effect on human U87-Luc on Balb/c nude female mice that were injected sub cutaneously. They indicate that a very substantial delay in tumor grow is initiated for plasma treated tumors compared to non-treated ones. Both in vitro and in vivo data highlight a major antitumor effect of plasma treatment, may be linked to an apoptosis induction.Studies are ongoing to elucidate mechanism of action of plasma in apoptosis induction and to understand the implication of the different plasma components in the cytotoxic effect. In parallel, series of experiments are now performed involving a new type of plasma applicator1 consisting in plasma gun that allows treatment at long distance from HV discharge. Fraction of millimeter size plasma probe was developed for mouse colon treatment. After a general presentation of the project, we will report on in vitro and in vivo FE DBD experiments concerning U87 before presenting first results on tolerance study and effect on in vitro cell lines using plasma gun.1. FR. WO2009050240 (2009), Centre National de la Recherche Scientifique (FR) and Université d’Orléans (FR), J.M. Pouvesle, C. Cachoncinlle, R. Viladrosa, A. Khacef, E. Robert, S. Dozias.________________________________* Work supported by the Région Centre, and Germitec and INEL companie

Non thermal plasma propagation in micro sized structures including bifurcations and connections

International audienceThis work reports on the development and characterization of a non thermal plasma source, labelled plasma gun, based on the generation and propagation of atmospheric pressure plasma in small diameter and large length flexible capillary. Among various potential applications in biomedical applications, our main target consists in the plasma gun matching for cancer therapeutic approach. Two unique features, dealing with the remote long distance plasma generation and the operation of the plasma gun at very moderate rare gas flow rate down to a few sccm, in comparison with the great variety of recently developed plasma jets, appear particularly attractive to first achieve plasma delivery in the tumor vicinity and second assess the toxicity and antitumor action of non thermal plasma. Both lung and colorectal cancers have been selected considering their rather poor prognosis using conventional therapies, while being especially challenging for in vivo studies using mice as animal models for these human pathologies.Besides the determination of the physical processes at the origin of plasma propagation at very high velocities, up to a few 108 cm.s-1, recent experiments have been performed to study the plasma expansion through micro sized in diameter silicon capillaries which can be used for mice tracheal intubation or colon endoscopy. The plasma delivery can either be planed as a direct exposure of the tumor surface or for less accessible targets through the plasma propagation in the organ cavities leading to the cancerous location. The first technique requires implementing non destructive diagnostic to monitor the capillary outlet position while the second protocol imposes preliminary characterization of the possibility for plasma splitting, expansion, shrinking, and connection as may be encountered in real organ topography. To this end, the plasma splitting and mixing have been studied in multi branched glass assemblies and in circular rings, using fast ICCD imaging. Both plasma splitting in glass assembly presenting up to ten successive bifurcations, and mixing of two “colliding” plasmas have been observed and characterized. These encouraging properties of atmospheric pressure ionization wave sustained plasma, lead us to perform preliminary endoscopic experiment on mice both for lung and colon targets. The propagation of plasma through small diameter flexible capillaries flushed at very gas flow in the lung and colon of anesthetized mice was recently successfully achieved. This first step opens up the possibility to plan in vivo plasma tolerance studies and antitumor evaluation

Plasmas froids pour des applications thérapeutiques

National audienceL’association plasmas froids et biologie n’est pas spécialement nouvelle (on peut rappeler que l’une des premières applications industrielles des plasmas a été la production d’ozone pour la désinfection de l’eau au début du siècle dernier), mais elle a pris un cours particulièrement intéressant ces dernières années au point qu’un nouveau champ de recherche est apparu : Plasma Medicine. Dans un premier temps, au cours des deux dernières décennies, de nombreuses équipes à travers le monde ont démontré de très intéressantes applications des plasmas froids hors équilibre (PFHE) dans les domaines de la stérilisation et de la décontamination, montrant là tout l’intérêt des interactions des plasmas avec le vivant. Dans un deuxième temps, beaucoup plus récemment, il a été montré que ces plasmas pouvaient présenter un intérêt énorme pour des applications thérapeutiques. L’engouement suscité par les recherches concernant les applications biomédicales des plasmas s’est récemment encore amplifié au point que de nombreuses conférences et workshops spécifiques ont été organisés en plus de sessions spécialisées dans tous les grands symposiums ou conférences plasmas. De même des numéros spéciaux de journaux ont été édités [1,2,3]. Une conférence internationale « International Conference on Plasma Medicine », ICPM, incluant aussi les procédés plasmas qui concernent les biomatériaux et l’ingénierie des tissus, a vu le jour en octobre 2007 aux USA, suivie par une seconde au printemps 2009, la troisième se déroulant en septembre de cette année à Greifswald en Allemagne. Parallèlement, un très récent rapport [4] du National Research Council of the National Academies of USA « Plasma Science, Advancing Knowledge in the National Interest » réalisé par le Plasma 2010 Committee, souligne l’extrême importance que les plasmas devraient prendre dans les Biotechnologies et la Médecine dans les années à venir. Ces domaines font partie des « Selected highlights » et sont présentés comme des domaines à très fort potentiel. Jusqu’à un passé très récent, les technologies plasmas avaient trouvé relativement peu d’applications dans le médical alors que de nombreuses avancées technologiques basées sur l’exploitation de divers phénomènes physiques, incluant lasers, RF et microondes, stimulation électrique et magnétique, ultrasons, rayonnements ionisants et beaucoup d’autres encore, ont transformé la pratique moderne de la médecine. Les avancées récentes réalisées dans le contrôle des plasmas froids hors équilibre, associées au fait que ces PFHE à l’air libre pouvaient efficacement traiter des tissus vivants sans les endommager, ont vraiment conduit à l’émergence de ce nouveau champ d’application des procédés plasmas qu’est la « Médecine Plasma », domaine particulièrement pluridisciplinaire impliquant plasmiciens, biologistes, biochimistes, médecins et ingénieurs. Les derniers développements dans le domaine montrent que de très nombreuses applications pourront être abordées. Cela concernent aussi bien le la coagulation du sang [5] ou la prévention du développement de bactéries sur des organes opérés, que les soins sur des plaies persistantes ou des ulcères [6], le traitement de cellules cancéreuses [7,8] ou de tumeurs [9] pour ne citer que ces quelques exemples. On doit aussi bien sûr mentionner tout ce qui concerne la prévention des infections au travers de l’éradication des organismes pathogènes qui se trouvent dans l’environnement immédiat du patient (corps et organes, instruments, air), applications liées à la stérilisation et décontamination [10]. A l’opposé des plasmas thermiques qui sont employés occasionnellement en médecine, par exemple pour l’électrocautérisation, l’hemostase ou la coupe de tissus [11], les PFHE offrent une plus grande flexibilité et permettent de créer des conditions préservant les tissus sains pour des traitements présentant a priori une meilleure sélectivité. L’activité des plasmas non-thermiques peut être a priori ajustée en adaptant les propriétés des plasmas générés en faisant varier les proportions de radicaux, d’espèces excitées, d’ions ou d’électrons et les flux de photons, principalement UV dont la production doit être extrêmement contrôlée [12] et aussi la maîtrise de la température au niveau de l’échantillon biologique . Les travaux n’en sont qu’à leurs débuts et les résultats observés sont dans la plupart des cas mal compris et les mécanismes d’actions très mal identifiés. Il existe un besoin énorme de travaux expérimentaux et de modélisation pour permettre de clarifier les modes d’actions des PFHE et des effets des diverses espèces présentes dans le plasma, notamment des ions, dans les divers traitements. En parallèle, des travaux plus fondamentaux sur les interactions espèces réactives/molécules d’intérêt biologiques doivent être poursuivis [13]. Un effort considérable est actuellement fait dans la plupart des grands pays industrialisés, Allemagne, USA, Japon, Russie, Grande Bretagne, pour rapprocher les communautés concernées et mettre en place des structures adaptées à l’instar de « Campus PlasmaMed » en Allemagne, qui regroupe l’INP-Greifswald, les universités de Greifswald et Rostock, et les deux universités des sciences appliquées de Stralsund et Neubrandenburg. En France, la communauté s’est rassemblée dans un GDR, ABioPLas, Applications Biomédicales des Plasmas, créé début 2010. Ce GDR devrait permettre de favoriser et renforcer les collaborations dans ce domaine où les laboratoires français sont particulièrement bien représentés.A côté des applications proprement dites, il existe un effort considérable pour le développement de nouveaux systèmes de décharges ou post décharge [14] permettant l’obtention de PFHE appropriés. Dans ce contexte, est apparu un certain nombre de développements concernant des générateurs de plasmas à la pression atmosphériques (Décharges à barrière diélectrique à potentiel flottant (FE-DBD), « aiguille plasma », jets de plasma) [8, 15, 16]. Dans la plupart des cas, les décharges générant les milieux plasmas sont créées à faible distance de la surface à traiter (~mm), soit à cause du type même de décharge (c’est le cas par exemple des décharges à barrière diélectrique, DBD) ou à cause de l’extinction rapide du plasma se propageant dans l’air (plume plasma DBD, aiguille plasma RF). Dans nombre de cas, il existe un intérêt évident pour la génération de plasmas à distance permettant de séparer la zone de décharge (utilisation de haute tension) et la cible à traiter. La mise au point du système Plasma gun [17], qui permet de générer des balles de plasmas sur des distances allant de quelques centimètres à plusieurs dizaines de centimètres, va peut-être permettre d’apporter une première réponse à ce problème. Après une introduction générale du sujet, la première partie de la présentation sera consacrée aux derniers développements à travers le monde concernant les applications biomédicales des plasmas et plus particulièrement les applications à la médecine, ainsi que la structuration des communautés concernées dans les principaux pays où ce domaine connaît une activité significative. La deuxième partie sera consacrée plus spécifiquement aux travaux effectués à Orléans dans le cadre du programme « Plasmed », consacré à l’étude des applications thérapeutiques des plasmas dans les domaines de la cancérologie et de la dermato-cosmétologie, avec des réacteurs FE-DBD et Plasma gun, in vitro et in vivo sur des souris (études de tolérance, efficacité antitumorale in-vitro, activation de facteurs de transcription, induction de l’apoptose, activité antitumorale in-vivo). D’ores et déjà, des résultats très encourageants ont été obtenus in vivo [9,18], montrant une activité antitumorale des plasmas dans le cas de glyoblastomes greffés (cellules tumorales U87-Luc humaines). Cette présentation sera aussi l’occasion de faire le point sur les nouvelles décharges mises en œuvre par diverses équipes, en particulier les jets de plasma à la pression atmosphérique et les « plasma gun » tels que ceux développés au GREMI.Références [1] Plasma Processes and Polymers, 3 (2006), Plasma Processes and Polymers, 5 (2008)[2] Plasma Process. Polym., 7 (2010)[3] Plasma Medicine J., 1, 1 (2010)[4] Plasma Science, Advancing Knowledge in the National Interest, Report of the National Research Council of the National Academies of USA, (Winter 2007)[5] M.Balasubramanian, ,A. Sebastian, M. Peddinghaus, G. Fridman, A. Fridman, A. Gutsol, G. Friedman, andB. Ari. Blood 108(11):89b-89b, (2006)[6] GLloyd, G Friedman, SJafri, G Schultz, AFridman, Keith Harding Plasma Process. Polym., 7, 194 (2010)[7] G C Kim, G J Kim, S R Park, S M Jeon, H J Seo, F Iza and J K Lee, J. Phys. D: Appl. Phys. 42 (2009) 032005[8] G Fridman, A Shereshevsky, MM Jost, et al., Plasma Chem. Plasma Process., 27, 163 (2007)[9] M. Vandamme, E. Robert, S. Pesnel, E. Barbosa, S. Dozias, J. Sobilo, S. Lerondel, A. Le Pape, J.-M. Pouvesle, Plasma Process. Polym., 7, 264 (2010)[10] M. Laroussi, IEEE Trans. Plas. Sci., 30, 1409 (2002)[11] J. J.Vargo, Gastrointest. Endosc. 59(1):81–88, 2004 [12] T Shimizu, T Nosenko, GE Morfill, T Sato, Hans-Ulrich Schmidt, Takuya Urayama, Plasma Process. Polym., 7, 288 (2010)[13] JS Sousa, G Bauville, B Lacour, V Peuch, M Touzeau, EPJ-AP 47, 22807 (2009)[14] E. Panousis, F. Clement, E. Lecoq, IEEE Trans. Plas. Sci. 36, 1338 (2008)[15] Kieft IE, Darios D, Roks AJM, Stoffels E, IEEE Trans. Plas. Sci., 33, 771 (2005)[16] X. Lu, M. Laroussi, J. Appl. Phys., 100, 063302 (2006)[17] E. Robert, E. Barbosa, S. Dozias, M. Vandamme, C. Cachoncinlle, R. Viladrosa, J.-M. Pouvesle, Plasma Process. Polym., 6, 795 (2009)[18] M. Vandamme, E. Robert, S. Dozias, J. Sobilo, S. Lerondel, A. Le Pape, J.-M. Pouvesle, Plasma Medicine J., 1, 1 (2010) in press

<i>In vivo</i> identification and monitoring of orthotopic lung tumors.

<p>(A) & (B) Detection of lung tumors by High Resolution Ultrasound Imaging. (A) 2D B-Mode acquisition on a healthy lung in mouse. Vertical white arrows point out the pleural line. Vertical yellow arrows correspond to A lines, representing reverberations of the pleural line. (B) On 2D B-Mode Ultrasound imaging of a lung bearing an orthotopic NCI-H460luc tumor (2.8mmx2.4mm), vertical red arrows point out the margins of the tumor, highlighted by the typical bright shadow artifact. We also remark white and yellow arrows indicating the pleural line and A lines respectively. (C) From 2D to 3D Ultrasound B-Mode imaging of a lung tumor in mouse. The red area corresponds to the lung tumor in the thoracic cavity of the mouse. The red grid corresponds to the tumor volume obtained by tracing margins on each 2D B-mode slices from the 3D acquisition. (D) Assessing tumor burden with BLI (left) and US (right), data are presented as mean ±SEM and statistically analyzed. A two-way repeated-measure analysis of variance followed by Bonferroni post-tests was used for the data of over time course. Differences were considered significant at p< 0.05. Left: Signal intensity from <i>in vivo</i> longitudinal monitoring of tumor proliferation by BLI following the deposition of 1.5x10⁵ or 2.5x10⁵ tumor cells (Photons/sec). Right: <i>In vivo</i> tumor volumes measured by US imaging using a transducer mounted on a 3D motor, comparing the tumor growth between 2 different tumor burdens (mm³). Results represent mean±SEM (n = 5 animals per groups). (***p<0.001; ****p<0.0001).</p