Amino acids substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins of a Vero cell-adapted mammalian orthoreovirus are required for optimal virus binding and disassembly

In a recent study, the serotype 3 Dearing strain of mammalian orthoreovirus was adapted to Vero cells; cells that exhibit a limited ability to support the early steps of reovirus uncoating and are unable to produce interferon as an antiviral response upon infection. The Vero cell-adapted virus (VeroAV) exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 outer capsid proteins but no changes in the σ3 protein. Accordingly, the virus was shown not to behave as a classical uncoating mutant. In the present study, an increased ability of the virus to bind at the Vero cell surface was observed and is likely associated with an increased ability to bind onto cell-surface sialic acid residues. In addition, the kinetics of μ1 disassembly from the virions appears to be altered. The plasmid-based reverse genetics approach confirmed the importance of σ1 amino acids substitutions in VeroAV's ability to efficiently infect Vero cells, although μ1 co-adaptation appears necessary to optimize viral infection. This approach of combining in vitro selection of reoviruses with reverse genetics to identify pertinent amino acids substitutions appears promising in the context of eventual reovirus modification to increase its potential as an oncolytic virus.Dans une étude récente, le réovirus de sérotype 3 (souche Dearing) a été adapté aux cellules Vero, cellules qui possèdent une capacité limitée à supporter les étapes précoces de décapsidation de réovirus et qui sont incapables de produire de l'interféron comme réponse antivirale lorsqu'elles sont infectées. Le virus adapté (VeroAV) possède des substitutions d'acides aminés au niveau des protéines de capside externe σ1 et μ1, mais ne présente pas de changement au niveau de la protéine σ3. Comme attendu, le virus ne se comporte donc pas comme un mutant de décapsidation classique. Dans la présente étude, une augmentation de la capacité du virus à se fixer à la surface des cellules Vero a été observée et est probablement associée à une augmentation de la fixation aux acides sialiques de la surface cellulaire. De plus, la cinétique de relâche de μ1 à partir des virions semble altérée. L'approche de génétique inverse a permis de confirmer l'importance des substitutions d'acides aminés de la protéine σ1 dans la capacité de VeroAV à infecter les cellules Vero de manière efficace, bien que la coadaptation de μ1 apparaisse nécessaire pour optimiser l'infection virale. Cette approche combinant la sélection in vitro de réovirus à la génétique inverse pour découvrir des substitutions importantes d'acides aminés apparaît prometteuse dans le contexte de la modification de réovirus afin d'accroître son potentiel en tant que virus oncolytique.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canad

A single amino acid substitution in the mRNA capping enzyme λ2 of a mammalian orthoreovirus mutant increases interferon sensitivity

In the last few years, the development of a plasmid-based reverse genetics system for mammalian reovirus has allowed the production and characterization of mutant viruses. This could be especially significant in the optimization of reovirus strains for virotherapeutic applications, either as gene vectors or oncolytic viruses. The genome of a mutant virus exhibiting increased sensitivity to interferon was completely sequenced and compared with its parental virus. Viruses corresponding to either the parental or mutant viruses were then rescued by reverse genetics and shown to exhibit the expected phenotypes. Systematic rescue of different viruses harboring either of the four parental genes in a mutant virus backbone, or reciprocally, indicated that a single amino acid substitution in one of λ2 methyltransferase domains is the major determinant of the difference in interferon sensitivity between these two viruses.Au cours des dernières années, la mise au point de la génétique inverse pour les réovirus de mammifères a permis la production et la caractérisation de virus mutants. Ceci pourrait être spécialement important pour l'optimisation de souches virales en vue d'applications thérapeutiques, comme vecteurs de gènes ou virus oncolytiques. Le génome d'un virus mutant démontrant une sensibilité accrue à l'interféron a été complètement séquencé et comparé au virus parental. Des virus correspondant au virus parental ou mutant ont ensuite été récupérés par génétique inverse et présentaient les phénotypes attendus. La récupération systématique de différents virus possédant un des quatre gènes parentaux dans un fond génétique du virus mutant, et réciproquement, a indiqué qu'une seule substitution d'acide aminé dans un des deux domaines méthyltransférase de λ2 est le déterminant majeur de la différence de sensibilité à l'interféron entre ces deux virus.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada

Multiple proteins differing between laboratory stocks of mammalian orthoreoviruses affect both virus sensitivity to interferon and induction of interferon production during infection

In the course of previous works, it was observed that the virus laboratory stock (T3DS) differs in sequence from the virus encoded by the ten plasmids currently in use in many laboratories (T3DK), and derived from a different original virus stock. Seven proteins are affected by these sequence differences. In the present study, replication of T3DK was shown to be more sensitive to the antiviral effect of interferon. Infection by the T3DK virus was also shown to induce the production of higher amount of β and α-interferons compared to T3DS. Two proteins, the μ2 and λ2 proteins, were found to be responsible for increased sensitivity to interferon while both μ2 and λ1 are responsible for increased interferon secretion. Altogether this supports the idea that multiple reovirus proteins are involved in the control of induction of interferon and virus sensitivity to the interferon-induced response. While interrelated, interferon induction and sensitivity can be separated by defined gene combinations. While both μ2 and λ2 were previously suspected of a role in the control of the interferon response, other proteins are also likely involved, as first shown here for λ1. This also further stresses that due caution should be exerted when comparing different virus isolates with different genetic background

Further characterization and determination of the single amino acid change in the tsI138 reovirus thermosensitive mutant

Many temperature-sensitive mutants have been isolated in early studies of mammalian reovirus. However, the bio- logical properties and nature of the genetic alterations remain incompletely explored for most of these mutants. The mutation harbored by the tsI138 mutant was already assigned to the L3 gene encoding the l1 protein. In the present study, this mu- tant was further studied as a possible tool to establish the role of the putative l1 enzymatic activities in viral multiplication. It was observed that synthesis of viral proteins is only marginally reduced, while it was difficult to recover viral particles at the nonpermissive temperature. A single nucleotide substitution resulting in an amino acid change was found; the position of this amino acid is consistent with a probable defect in assembly of the inner capsid at the nonpermissive temperature.Plusieurs mutants thermosensibles ont été rapidement isolés dès le début de l’étude du réovirus de mammifères. Cependant, les propriétés biologiques et la nature des changements génétiques demeurent peu connues pour la plupart de ces mutants. La mutation au sein du mutant tsI138 a déjà été localisée comme étant présente sur le gène L3 codant pour la protéine l1. Dans la présente étude, ce mutant a été étudié davantage comme outil possible pour établir le rôle des poten- tielles activités enzymatiques de l1 dans la multiplication virale. Il a été observé que la synthèse des protéines virales est peu affectée alors qu’il est difficile de récupérer des particules virales à température non permissive. La substitution d’un seul nucléotide, entraînant le changement d’un acide aminé, a été retrouvée; la position de cet acide aminé est compatible avec un défaut probable d’assemblage de la capside interne à la température non permissive.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canad

Addition of exogenous polypeptides on the mammalian reovirus outer capsid using reverse genetics

Addition of exogenous peptide sequences on viral capsids is a powerful approach to study the process of viral infection or to retarget viruses toward defined cell types. Until recently, it was not possible to manipulate the genome of mammalian reovirus and this was an obstacle to the addition of exogenous sequence tags onto the capsid of a replicating virus. This obstacle has now been overcome by the advent of the plasmid-based reverse genetics system. In the present study, reverse genetics was used to introduce different exogenous peptides, up to 40 amino acids long, at the carboxyl-terminal end of the σ1 outer capsid protein. The tagged viruses obtained were infectious, produce plaques of similar size, and could be easily propagated at hight titers. However, attempts to introduce a 750 nucleotides-long sequence failed, even when it was added after the stop codon, suggesting a possible size limitation at the nucleic acid level.L'addition aux capsides virales de séquences peptidiques exogènes est une approche puissante pour l'étude des processus d'infection virale ou pour cibler des virus vers des types cellulaires bien définis. Jusqu'à récemment, il n'était pas possible de manipuler le génome du réovirus de mammifères et ceci était un obstacle à l'addition de telles étiquettes exogènes sur la capside d'un virus pouvant se répliquer. Cet obstacle a maintenant été surmonté par la mise au point d'un système de génétique inverse à base de plasmides. Dans la présente étude, la génétique inverse a été utilisée pour introduire différents peptides exogènes, jusqu'à 40 acides aminés de longueur, à l'extrémité carboxyle de la protéine de capside externe σ1. Les virus obtenus étaient infectieux, produisent des plages de taille similaire, et peuvent être propagés facilement. Cependant, les efforts pour introduire une séquence de 750 nucléotides de longueur ont été infructueux, même lorsqu'un codon de terminaison était introduit avant celle-ci, suggérant une limite de taille au niveau des acides nucléiques.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canad

La génétique inverse dans l'étude des réovirus: Progrès, obstacles et développements futurs

En génétique dite « classique », l’examen d’un phénotype conduit à l’étude des gènes impliqués dans son obtention. La génétique inverse est une méthode expérimentale très puissante dans laquelle, au contraire, le matériel génétique est modifié et utilisé pour reconstruire un organisme complet, afin de déterminer le résultat de ces modifications. Cette approche est spécialement bien adaptée à l'étude des virus, compte tenu de la relative simplicité et de la petite taille de leurs génomes; l’obstacle principal demeure de récupérer des virus infectieux à partir de génomes viraux clonés. Au cours des années, cet exploit a été accompli pour des représentants de presque toutes les familles de virus de mammifères. Jusqu’à récemment, les Reoviridae, virus à génome d'ARN bicaténaire segmenté, faisaient toutefois exception. Dans cette revue, les progrès réalisés vers la mise au point de la génétique inverse pour l'étude du réovirus seront discutés. La génétique inverse pourrait avoir un impact majeur dans l'optimisation de nouvelles souches de réovirus pour leur utilisation en thérapie comme agents oncolytiques et pour le développement de vaccins dans le cas des rotavirus et des orbivirus. Les travaux actuels font toutefois ressortir les limites de l'approche, la nécessité d’une analyse prudente des résultats obtenus, ainsi que le besoin de développer des systèmes plus efficaces et polyvalents.In « classical » genetics, examination of a phenotype leads to the study of the gene(s) involved in its obtention. Reverse genetics is a powerful experimental approach in which, on the contrary, the genetic material is modified and used to reconstruct a complete organism, in order to study the result of these modifications. This approach is especially well adapted to the study of viruses, considering their relative simplicity and small size of their genomes; the main obstacle remains to recover infectious viruses from cloned viral genomes. Over the years, this exploit has been achieved with representatives of almost all families of mammalian viruses. Until recently, the Reoviridae, viruses with segmented double-stranded RNA genome, were an exception. In this review, the progress accomplished toward the development of such an approach for the reovirus will thus be discussed. Reverse genetics could have a major impact for the optimization of novel reovirus strains for their use in therapy as oncolytic viruses and for the development of vaccines in the case of rotaviruses and orbiviruses. However, current works stress the limitations of the approach, the need for careful analysis of the results obtained, as well as the necessity to develop more efficient and polyvalent systems

Amino acid substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins are selected during mammalian reovirus adaptation to Vero cells

Establishment of viral persistence in cell culture has previously led to the selection of mammalian reovirus mutants, although very few of those have been characterized in details. In the present study, reovirus was adapted to Vero cells that, in contrast to classically-used L929 cells, are inefficient in supporting the early steps of reovirus uncoating and are also unable to produce interferon as an antiviral response once infection occurs. The Vero cell-adapted reovirus exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 proteins. This contrasts with uncoating mutants from persistently-infected L929 cells, and various other cell types, that generally harbor amino acids substitutions in the σ3 outer capsid protein. The Vero cell-adapted virus remained sensitive to an inhibitor of lysosomal proteases; furthermore, in the absence of selective pressure for its maintenance, t he virus has partially lost its ability to resist interferon. The positions of the amino acids substitutions on the known protein structures suggest an effect on binding of the viral σ1 protein to the cell surface and on μ1 disassembly from the outer capsid.L'établissement de la persistance virale en culture cellulaire a précédemment mené à la sélection de mutants de réovirus, bien que peu d'entre eux aient été caractérisés en détail. Dans la présence étude, le réovirus a été adapté aux cellules Vero qui, contrairement aux cellules L929 classiquement utilisées, sont peu efficaces pour les étapes précoces de décapsidation de réovirus et sont également incapables de produire de l'interféron comme réponse antivirale, lorsqu'infectées. Le réovirus adapté aux cellules Vero porte des substitutions d'acides aminés à la fois dans les protéines σ1 et μ1. Ceci contraste avec les mutants de décapsidation des cellules L929 infectées de manière persistante, aussi bien que chez divers autres types de cellules, qui présentent généralement des substitutions d'acides aminés au niveau de la protéine de capside externe σ3. Le virus adapté aux cellules Vero demeure sensible à un inhibiteur de protéases lysosomales; de plus, en absence de pression de sélection, le virus a perdu en partie sa capacité à résister à l'interféron. La position des différentes substitutions d'acides aminés sur la structure connue de la protéine suggère un effet sur la fixation de la protéine virale σ1 à la surface cellulaire et sur l'élimination de la protéine μ1 de la capside externe du virus.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canad

Transient high level mammalian reovirus replication in a bat epithelial cell line occurs without cytopathic effect

Mammalian reoviruses exhibit a large host range and infected cells are generally killed; however, most studies examined only a few cell types and host species, and are probably not representative of all possible interactions between virus and host cell. Many questions thus remain concerning the nature of cellular factors that affect viral replication and cell death. In the present work, it was observed that replication of the classical mammalian reovirus serotype 3 Dearing in a bat epithelial cell line, Tb1.Lu, does not result in cell lysis and is rapidly reduced to very low levels. Prior uncoating of virions by chymotrypsin treatment, to generate infectious subviral particles, increased the initial level of infection but without any significant effect on further viral replication or cell survival. Infected cells remain resistant to virus reinfection and secrete an antiviral factor, most likely interferon, that is protective against the unrelated encephalomyocarditis virus. Although, the transformed status of a cell is believed to promote reovirus replication and viral “oncolysis”, resistant Tb1.Lu cells exhibit a classical phenotype of transformed cells by forming colonies in semisolid soft agar medium. Further transduction of Tb.Lu cells with a constitutively-active Ras oncogene does not seem cell growth or reovirus effect on these cells. Infected Tb1.Lu cells can produce low-level of infectious virus for a long time without any apparent effect, although these cells are resistant to reinfection. The results suggest that Tb1.Lu cells can mount an unusual antiviral response. Specific properties of bat cells may thus be in part responsible for the ability of the animals to act as reservoirs for viruses in general and for novel reoviruses in particular. Their peculiar resistance to cell lysis also makes Tb1.Lu cells an attractive model to study the cellular and viral factors that determine the ability of reovirus to replicate and destroy infected cells.Les réovirus de mammifères possèdent un large spectre d'hôtes et les cellules infectées sont généralement tuées par l'infection ; cependant, la plupart des études utilisent seulement certains types de cellules provenant de quelques espèces animales. Ceci n'est sans doute pas représentatif de toutes les interactions possibles entre virus et cellule hôte. Plusieurs questions demeurent concernant la nature des facteurs cellulaires qui affectent la réplication virale et la mort cellulaire. Dans la présente étude, il a été observé que la réplication du classique réovirus de mammifères (sérotype 3 Dearing) dans une lignée de cellules épithéliales de chauve-souris, Tb1.Lu, n'entraîne pas la lyse cellulaire et est rapidement réduite à un très faible niveau. La décapsidation des virions par traitement à la chymotrypsine, afin de générer des particules dites « sous-virales infectieuses », augmente le niveau initial d'infection sans effet significatif sur la réplication virale ou la survie cellulaire. Les cellules infectées demeurent résistantes à la réinfection et sécrètent un facteur antiviral, probablement de l'interféron, qui peut protéger contre l'infection par le virus de l'encéphalomyocardite. Malgré le fait que le statut de transformation cellulaire est considéré comme pouvant promouvoir la réplication de réovirus et l'oncolyse virale, les cellules Tb1.Lu résistantes démontrent un phénotype classique de cellules transformées et forment des colonies en milieu semi-solide contenant de l'agar. La transduction de cellules Tb1.Lu avec un oncogène Ras constitutivement actif ne semble pas affecter la croissance cellulaire ni la réplication virale. Les cellules Tb1.Lu infectées peuvent produire une faible quantité de virus infectieux pour une longue période sans effet apparent, malgré le fait que ces cellules soient résistantes à la réinfection. Ces résultats suggèrent que les cellules Tb1.Lu peuvent développer une réponse antivirale inhabituelle. Les propriétés spécifiques des cellules de chauve-souris pourraient donc être en partie responsables de la capacité de ces animaux à agir comme réservoirs de virus en général et de nouveaux réovirus en particulier. Leur résistance particulière à la lyse cellulaire fait aussi de ces cellules un modèle attrayant pour étudier les facteurs cellulaires et viraux qui déterminent la capacité de réovirus à se répliquer et à détruire les cellules infectées.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canad