Unravelling the reaction mechanism of glutamate amidation in Staphylococcus aureus peptidoglycan

MurT-GatD is the bi-enzymatic complex responsible for catalysing the amidation of peptidoglycan in Gram-positive bacteria, ensuring the correct assembly of their cell wall. MurT-GatD is essential in antibiotic resistant human pathogens such as Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis, and therefore, constitutes a promising target for the development of new antimicrobial agents. Peptidoglycan amidation is achieved through the glutamine amidotransferase activity of the MurT-GatD complex, requiring the presence of glutamine, ATP and magnesium. The main goal of this thesis is to unravel the reaction mechanism of peptidoglycan amidation through an integrative approach that combines structural methods with functional assays, in order to characterize the structure-function relationship of the S. aureus MurT-GatD complex. The crystal structure of isolated S. aureus GatD was solved at 1.9 Å of resolution (PDB 5N9M) and provided the first structural insights into the MurT-GatD complex. GatD adopts the overall fold of glutaminase proteins and shows the nucleophilic cysteine and the polarizing histidine commonly associated with glutamine hydrolysis. 1H-NMR experiments showed that GatD C94A or H189A abolished the glutaminase activity of the complex. Similarly, GatD R128 also proved to be an essential residue for catalysis, likely by capturing glutamine to the active site. The crystal structure of S. aureus MurT-GatD was solved at 2.9 Å of resolution (PDB 7Q8E), showing a heterodimer in an extended conformation. GatD adopts the same glutaminase-like fold as in its isolated form, while MurT displays two distinct domains: the central domain containing, a cysteine-rich insertion and the ATP binding site, and the C-terminal domain that interacts with GatD. The overall structure of S. aureus MurT-GatD is very different from S. pneumoniae MurT-GatD, which adopts a compact conformation. The two complexes also adopt different conformations in solution, as observed through Small-Angle X-ray Scattering (SAXS) studies, and showed different in vitro enzymatic activities, suggesting that the extended conformation of S. aureus MurT-GatD is catalytically less competent. The structural data of MurT-GatD from S. aureus and S. pneumoniae were combined to identify the molecular determinants involved in the glutaminase and amidotransferase active sites of the complex, as well as, in protein-protein interactions. The work carried out in this thesis contributed to the clarification of the reaction mechanism of peptidoglycan amidation, which can be explored for the development of new drugs with antimicrobial activity.MurT-GatD é o complexo bi-enzimático que catalisa a amidação do peptidoglicano em bactérias Gram-positivas, garantindo a correta organização da sua parece celular. MurT-GatD é essencial em bactérias resistentes a antibióticos que são patogénicas a humanos, como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis, e, consequentemente constitui um alvo promissor a ter em conta no desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. A amidação do peptidoglicano é realizada pela actividade de glutamina amidotransferase do complexo MurT-GatD, requerendo a presença de glutamina, ATP e magnésio. O principal objectivo desta tese é revelar o mecanismo reaccional da amidação do peptidoglicano através de uma abordagem integrativa que combina métodos estruturais com ensaios funcionais, de modo a caracterizar a relação estrutura-função do complexo MurT-GatD de S. aureus. A estrutura cristalina da proteína GatD de S. aureus foi resolvida a 1.9 Å de resolução (PDB 5N9M) e forneceu as primeiras evidências estruturais sobre o complexo MurT-GatD. GatD adopta uma organização 3D semelhante a glutaminases, apresentando uma cisteína nucleofílica e uma histidina polarizadora comummente associadas à hidrólise de glutamina. Experiências de 1H-NMR mostraram que os mutantes C94A ou H189A da GatD aboliram a actividade de glutaminase do complexo. De forma similar, R128 da GatD também provou ser um resíduo essencial na catálise, provavelmente por capturar glutamina para o centro activo. A estrutura cristalina do complexo MurT-GatD de S. aureus foi resolvida a 2.9 Å de resolução (PDB 7Q8E), mostrando um heterodímero numa conformação estendida. A GatD adopta a mesma organização estrutural característica de glutaminases, enquanto a MurT apresenta dois domínios distintos: o domínio central que contém uma inserção rica em cisteínas e o local de ligação ao ATP, e o domínio C-terminal que interage com a GatD. A estrutura global do complexo MurT-GatD de S. aureus é muito diferente do complexo MurT-GatD de S. pneumoniae, tendo em conta que este adopta uma conformação compacta. Os dois complexos também adoptam diferentes conformações em solução, como observado através de estudos de Dispersão de raios X a Baixo Ângulo (SAXS), tendo demonstrado diferentes actividades enzimática in vitro, sugerindo que a conformação estendida de MurT-GatD de S. aureus é cataliticamente menos competente. Os dados estruturais sobre o complexo MurT-GatD de S. aureus e S. pneumoniae foram combinados para identificar os determinantes moleculares envolvidos nos centros activos de glutaminase e de amidotransferase do complexo, assim como, nas interacções proteína-proteína. O trabalho desta tese teve uma importante contribuição para a elucidação do mecanismo reaccional da amidação do peptidoglicano, o que pode vir a ser explorado no desenvolvimento de novos fármacos com actividade antimicrobiana

Descoberta de marcadores de patogenicidade em B. xylophilus

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia MolecularBursaphelenchus xylophilus, o nemátode-da-madeira-do-pinheiro, é o agente causador da doença da murchidão do pinheiro e é considerado uma das mais perigosas pestes para os ecossistemas onde foi introduzido. A biologia e ecologia do nemátode que estão estritamente associadas à indução da doença têm sido extensivamente estudadas. No entanto, as interações desencadeadas entre as plantas e os nemátodes durante o desenvolvimento da doença da murchidão do pinheiro continuam por esclarecer. Para elucidar esta interacção utilizou-se uma abordagem de transcritómica comparativa. O transcritoma de B. xylophilus foi comparado com o de B. mucronatus, um nemátode filogeneticamente próximo e incapaz de induzir murchidão em pinheiros, Adicionalmente, foram comparados entre si, os transcritomas de B. xylophilus machos, fêmeas e JIII, isolados de pinheiro, assim como estes três transcritomas contra o de B. xylophilus crescido em fungo. Diversas estratégias de transcritómica comparativa e diferentes ferramentas bioinformáticas foram integradas, permitindo a identificação de 28 genes cuja expressão relativa foi quantificada entre as amostras em estudo por RT-PCR. Todos os genes analisados apresentam níveis de expressão significativamente diferentes entre as amostras, com prevalência na comparação entre nemátodes crescidos em fungo e planta. As estratégias utilizadas identificaram o metabolismo do homogentisato como diferencialmente ativo entre as amostras. O envolvimento deste composto no combate ao stress oxidativo sugere a sua potencial ação no mecanismo de parasitismo do nemátode. Esta é a primeira evidência da ativação deste mecanismo em B. xylophilus, com especial interesse na sua ativação em planta durante o parasitismo. Genes de fosfatases ácido roxas, catepina L e cistatina 5 apresentaram os maiores níveis de expressão em nemátodes crescidos em planta face a fungo, apresentando sobre-expressões de 200, 110 e 16 vezes superiores, respetivamente. As fosfatases ácido roxas são potencialmente secretadas e podem estar envolvidas na produção de espécies reativas de oxigénio. A catepsina L pode promover uma interação direta entre o nemátode e o pinheiro, sendo um alvo já estudado para controlo de nemátodes parasitas de plantas. A cistatina 5 tem sido associada a um mecanismo de fuga ao sistema de reconhecimento de hospedeiros em nemátodes parasitas. Outros genes foram identificados neste estudo como o da trealase, uma enzima que actua sobre trealose, um polissacarídeo associado à destoxificação oxidativa em nemátodes. Várias proteínas envolvidas no proteossoma celular, nomeadamente na garantia da produção de enzimas funcionais, foram também evidenciadas. A ativação deste processo poderá permitir uma ação mais rápida na resposta do nemátode a estímulos externos como os encontrados dentro do pinheiro. A análise experimental futura dos genes estudados evidenciará processos relevantes na biologia e no parasitismo do nemátode e poderá revelar a potencialidade de utilização de alguns deles no controlo do nemátode.Bursaphelenchus xylophilus, known as the pinewood nematode, is the causative agent of pine wilt disease and is considered one of the most dangerous pests to worldwide ecosystems where it was introduced. Pinewood nematode biology and ecology that are strictly associated to disease induction have been extensively investigated. However, plant-nematode interactions triggered during pine wilt disease development remain unclear. A comparative transcriptomics approach was used to elucidate this interaction. B. xylophilus transcriptome was compared to transcriptome of B. mucronatus, which is a phylogenetically close nematode of B. xylophilus and unable of wilting in pine trees. Additionally, the transcriptomes of B. xylophilus males, females and JIII isolated from pine trees were compared among them and against B. xylophilus grown on fungi. Several strategies of comparative transcriptomics and different bioinformatics tools were integrated allowing the identification of 28 genes. Their relative expression was measured in all samples under study by RT-qPCR. All analyzed genes presented levels of expression significantly different, with special attention on the comparison of nematodes grown in fungi and plant. The strategies used identified homogentisate metabolism as differentially activated between samples. The role of homogentisate in oxidative stress detoxification suggests their potential action in the parasitism mechanism of nematode. This is the first evidence of the activation of homogentisate mechanism in B. xylophilus, including their presence during parasitism. Genes of purple acid phosphatases, cathepsin L and cystatin 5 presented the highest expression levels in nematodes grown on pine comparing to those grown on fungi. Their expression levels were of about 200, 110 and 16 times, respectively. Purple acid phosphatases are probably secreted and are involved in reactive oxygen species production. Cathepsin L may promote a direct interaction between the nematode and pine, being a target already studied for plant parasitic nematodes control. Cystatin 5 has been associated with a host recognition of parasitic nematodes escape mechanism. Other genes were identified in this study, such as trehalase, the enzyme that cleaves trehalose. This polysaccharide is involved in nematode oxidative detoxification. Several proteins involved in the production of cellular proteasome, particularly in ensuring the production of functional enzymes were also evidenced. Activation of this process may allow a faster response to external stimuli such as those occurring inside the pine tree. The future experimental analysis genes identified will elucidate relevant processes in B. xylophilus biology and parasistism. Some of these genes may become useful for nematode control