The use of high halide-ion concentrations and automated phasing procedures for the structural analysis of BclA, the major component of the exosporium of Bacillus anthracis spores.

International audienceThe structure determination of the recombinant form of BclA, the major protein component of Bacillus anthracis exosporium, involved soaking in a high concentration of potassium iodide as the means of obtaining a good-quality heavy-atom derivative. The data to 2 angstroms resolution collected on a laboratory source were of sufficient quality to allow successful phasing and chain tracing by automated methods

Influence des carences en oxygène sur la prolifération des bactéries filamenteuses en boues activées

Le foisonnement filamenteux affecte 25% des stations françaises à boues activées. Il se traduit par un développement massif de bactéries filamenteuses et peut avoir des conséquences néfastes sur les milieux récepteurs. Dans une première partie, l'influence des carences en oxygène sur la prolifération des bactéries filamenteuses a été étudiée sur pilotes. Une seule période de carence en oxygène n'induit que des développements faibles des filaments S.natans, Thiothrix sp, type 021N, H.hydrossis et N.limicola-like. La combinaison des carences en oxygène avec des facteurs comme les à-coups de charge ou les carences en azote aboutit dans certains cas aux foisonnements des filaments S.natans,H.hydrossis ou N.limicola-like. L'accumulation des périodes de stress semble être déterminante dans l'apparition d'un foisonnement. En effet, l'application répétée de stress identiques induit au cours du temps une amplification de la réponse des bactéries filamenteuses. Cette dernière est fonction de l'intensité, de la fréquence et du nombre de stress appliqués...Twenty five percent of french suffer from activated sludge bulking. It induces an excessive growth of filamentous bacteria and can cause severe damages to the environment. In a first part, the influence of oxygen deficiencies on filamentous bacteria proliferation has been studied in wastewater treatment pilots plants. A sole period of oxygen deficiency only induces weak growth of filaments such as S.natans, Thiothrix sp, Eikelboom type 021N or N.limicola-like microorganisms. Accumulate stress periods seems to have a great impact on the filamentous bacteria proliferation. Repetition of identical stresses causes an amplification of filamentous bacteria response. The latter depends on stresses intensity, stresses application frequency and stresses number. Accumulate oxygen deficiencies led to the bulking of S.natans and important developments of Thiothrix sp and Eikelboom type 021N.The second part deals with morphological transition of the bacterium Sphaerotilus...ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Expression de l'activité des bactéries nitrosantes issues de stations d'épuration en milieu Seine (étude en réacteurs)

La station d'épuration d'Achères est responsable d'un important apport d'ammonium en Seine. Les stations de Colombes et de Valenton, de conception récente, nitrifient les ERU. Toutes ces stations contribuent potentiellement à enrichir le milieu récepteur en bactéries nitrifiantes. L'ajout des nitrosantes issues des rejets des stations d'épuration à celles de la Seine, induit une nitrification plus précoce qu'en présence de la seule fraction biotique de la Seine. A l'inverse, à concentrations initiales de nitrosantes équivalentes, issues de l'eau de Seine et des rejets des stations de Valenton et de Colombes, les cinétiques de nitrosation sont semblables. Les cinétiques de nitrosation en présence des nitrosantes issues des rejets de la station d'Achères sont systématiquement plus tardives. La raison en est une vraisemblable surestimation de la concentration des nitrosantes dans ces échantillons. L'origine des rejets n'influencerait pas l'activité spécifique de nitrosation. Elle sera logiquement d'autant plus précoce que la concentration initiale en nitrosantes sera grande. De plus, les effectifs de nitrosantes augmentent au cours de la nitrosation. Enfin, un inventaire moléculaire basé sur l'ADNr16S a mis en évidence la présence de la seule espèce nitrosante Nitrosomonas oligotropha dans les rejets de la station d'épuration de Valenton. Le suivi de la dynamique de cette espèce par QPCR, a montré sa dominance dans la colonne d'eau au cour de la nitrosation en réacteur en présence des fractions biotiques issue de l'eau de Seine et des rejets de la station de Valenton. Cette espèce est présente dans l'ensemble des rejets de stations testées en QPCR.The wastewater treatment plant (WWTP) of Achères releases an important quantity of ammonia in the Seine River. The recent Colombes and Valenton WWTP nitrify wastewater. All these plants may provide autotrophic ammonia oxidizing bacteria (AOB) in the Seine River. The goal of this work is to describe the impact of nitrifying and non nitrifying WWTP on potential ammonia oxidizing kinetics to characterize nitrification in water column of the Seine River. Addition of AOB from WWTP effluents to non sterilized water of the Seine River, induced an earlier ammonia oxidizing kinetic than with the sole ammonia oxidizing biomass of the Seine River. At the same initial AOB concentration, from the Seine River and from Colombes and Valenton WWTP effluents, ammonia oxidizing kinetics were similar. With AOB from Achères WWTP effluent, the onset of the ammonia-oxidizing activity was delayed AOB concentration in these samples could have been probably overestimate. Specific ammonia oxidation activities would not be influenced by WWTP process. Higher concentration of AOB is expected to be related to faster onset of AOB activity. During the ammonia oxidation, AOB populations grow. A 165 rRNA gene clones library of AOB community showed Nitrosomonas oligotropha as sole AOB species in Valenton WWTP effluent. The survey of bacterial dynamics by QPCR, showed that this population is dominant, in the water column, during the ammonia oxidation in batch when ammonia oxidizers community from the Seine River and Valenton WWTP effluent were not sterilized. In addition, this species was found in all WWTP effluents investigated by QPCR.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Groupes microbiens fonctionnels impliqués dans la méthanisation de la cellulose et du méthanol (diversité, fonction et influence de la température)

Afin de mieux comprendre le fonctionnement des communautés microbiennes intervenant lors de la méthanisation de la cellulose et du méthanol, des échantillons issus de la digestion anaérobie de déchets ont été incubés en présence de cellulose, de glucose, d'acétate et de méthanol enrichis en carbone 13, en conditions mésophiles et thermophiles. Après extraction et séparation de l'ADN lourd et léger par ultracentrifugation sur des gradients de densité (technique SIP), la diversité fonctionnelle a été caractérisée par inventaire moléculaire et analyse phylogénétique. Au total, 20 banques de clones contenant des gènes d'ADNr 16S bactériens (1251 séquences) et 19 banques de clones contenant des gènes ADNr 16S archéens (1312 séquences) ont été obtenues en conditions mésophiles et thermophiles. Des oligonucléotides spécifiques ont ensuite été élaborés et hybridés selon la technique d'hybridation fluorescente in situ afin de confirmer la présence des groupes fonctionnels pré-identifiés. Nous nous sommes ensuite attachés à étudier la relation entre la cinétique de dégradation, les voies métaboliques activées et les groupes fonctionnels impliqués, en suivant la dynamique des diversités fonctionnelles à l'aide de la technique du polymorphisme de conformation simple brin (SSCP). En appliquant de manière combinée ces techniques sur une série de substrats fonctionnellement connectés, nous dévoilons des réseaux de microorganismes non cultivables impliqués dans la méthanisation de la cellulose et du méthanol. La température d'incubation influence la diversité générale tandis que l'ajout de substrats joue un rôle important sur la diversité fonctionnelle. Les microorganismes appartenant au genre Acetivibrio et à l'ordre Halanaerobiales sont, respectivement, les principaux groupes hydrolysant la cellulose en conditions mésophiles et thermophiles. Les microorganismes appartenant à la famille Porphyromonadaceae et au genre Clostridium sont les principaux fermenteurs du glucose. Par ailleurs, de nombreux microorganismes appartenant à la classe Clostridia, mais éloignés de toutes les souches cultivables répertoriées, ont été identifiés comme des groupes fonctionnels dans toutes les incubations. L'oxydation syntrophique de l'acétate est un processus important dans cet écosystème, qui pourrait être effectué par des microorganismes proches du genre Pseudomonas en conditions mésophiles. Une grande versatilité fonctionnelle a été mise en évidence pour les microorganismes thermophiles et pourrait contribuer à expliquer une dégradation de la cellulose plus rapide et efficace par rapport à celle observée en conditions mésophiles. Enfin, une nouvelle technique, baptisée "SIMSISH" (Secondary Ion Mass Spectrometry In Situ Hybridization), a été développée dans le cadre du travail. Elle permet de visualiser simultanément l'identité microbienne et de mesurer l'enrichissement isotopique à l'échelle d'une cellule. Couplée aux méthodologies SIP, cette technique devrait permettre des progrès décisifs pour l'étude in situ de la contribution des populations microbiennes non cultivables au fonctionnement des écosystèmes complexes.In order to better understand functional communities of microbes catalyzing methanization of cellulose and methanol, samples from municipal solid waste anaerobic digester were incubated with 13C-cellulose, 13C-glucose, 13C-acetate and 13C-methanol under mesophilic and thermophilic conditions. Firstly, the functional diversity was characterized by coupling DNA stable isotope probing (SIP) to phylogenetic analysis. Totally 20 bacterial clone libraries (1251 sequences) and 19 archaeal clone libraries (1312 sequences) of 16S rRNA gene were obtained for both mesophilic and thermophilic conditions. Then, specific FISH probes were designed and hybridized to confirm the presence in situ of pre-identified functional groups. Secondly, we studied the relationships between degradation kinetics, metabolic pathways and microbial functional diversity dynamics, using time-course DNA-SIP coupled to PCR-single strand conformation polymorphism. Thanks to the combination of these techniques on a series of functionally connected substrates, we shed light on the networks of uncultured microbes catalyzing the methanization of cellulose and methanol. Incubation temperature shaped the general microbial diversity while the added substrates played an important role on the functional diversity. Microorganisms affiliated with the genus Acetivibrio and the order Halanaerobiales were respectively the principal cellulose hydrolyzers under mesophilic and thermophilic conditions, whereas microorganisms affiliated with the family Porphyromonadaceae and the genus Clostridium were the main glucose fermenters. Besides, large amount of microorganisms affiliated with class Clostridia, but distantly related to any hitherto cultured strain, were identified as functional groups in all degradation experiments. Syntrophic oxidation of acetate was an important process in this ecosystem both under mesophilic and thermophilic conditions. Interestingly, our results suggest that Pseudomonas-related microorganisms were involved in this process under mesophilic conditions. A high functional versatility of microbial groups was evidenced under thermophilic conditions which could contribute to a more rapid and efficient cellulose degradation compared to mesophilic conditions. Finally, a new technique called SIMSISH was developed during this work providing the possibility to simultaneously visualize the microbial identity and measure the isotopic enrichment at the single cell level. Combined to SIP analysis, this technique might allow a decisive step forward for the study of the function of uncultured microbes within their environments.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Approche physiologique de la production de protéines recombinantes dans une logique globale haut débit

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Corynebacterium glutamicum modèle d'étude de l'enveloppe des Corynebacterineae (identification et analyse fonctionnelle de gènes impliqués dans la biosynthèse des acides mycoliques)

Les Corynebacterineae (Corynebacteria, Mycobacteria, Nocardia) sont des bactéries à Gram positif qui se distinguent par la présence d'une membrane externe " like " : la mycomembrane, bicouche lipidique composée entre autres d'acides mycoliques. L'étude in silico des génomes disponibles des Corynebacterineae a permis d'identifier et de caractériser, le gène pks13 qui code l'enzyme, inconnue jusqu'ici, catalysant l'étape clef de la biosynthèse des acides mycoliques condensant deux molécules d'acides gras. Létale chez Mycobacterium, l'absence d'acides mycoliques confère à Corynebacterium glutamicum un phénotype particulier. Nous avons pu montrer que les gènes flanquants pks13 : fadD32 (codant une acyl-AMP ligase) et accD4 (codant une sous-unité carboxyltransférase de l'acétyl-CoA carboxylase) activent les acides gras substrats de la condensation. Ce résultat montre que Corynebacterium glutamicum est un bon modèle d'étude de la biosynthèse des éléments pariétaux caractéristiques des Corynebacterineae.Au cours de ce travail de thèse, plusieurs gènes codant des enzymes catalysant le transfert des mycolates sur leurs différents accepteurs ont été identifiés chez Corynebacterium glutamicum et leur activité a permis de définir différentes classes de mycoloyltransférases (cMyts). L'inactivation de plusieurs cMyts d'une même classe a révélé des perturbations très importantes dans la mycomembrane. Les gènes fadD32, pks13, accD4 ainsi quedeux des gènes cmyts sont regroupés dans un cluster de gènes à l'organisation très conservée entre Mycobacterium et Corynebacterium et qui serait impliqué dans la biosynthèse de l'enveloppe. Certains de ces gènes sont en cours d'étude.Corynebacterineae (Corynebacteria, Mycobacteria, Nocardia) are Gram positive bacteria which are characterized by the presence of an external membrane "like": the mycomembrane, a phospholipid bilayer containing mycolic acids. The in silico analysis of several available Corynebacterineae's genomes allowed the identification and characterisation of the pks13 gene which encodes the enzyme, catalysing the key stage of mycolic acids biosynthesis : condensation of two molecules of fatty acids. While the absence of mycolic acids is lethal for Mycobacterium, it confers a particular phenotype to Corynebacterium glutamicum. We have shown that genes flanking pks13 activate the fatty acid substrates for the condensation reaction : fadD32 (encoding an acyl-AMP ligase) and accD4(encoding a carboxyltransferase subunit of an acetyl-CoA carboxylase). This result shows that Corynebacterium glutamicum is a very good model for the study of biosynthesis of the characteristic Corynebacterineae parietal compounds. During this work, several genes encoding enzymes catalysing the transfer of mycolates on their various acceptors, were identified and various classes of mycoloyltransférases (cMyts) were defined. The inactivation of two cmyts of the same class produced a mutant severely affected in its cell wall composition and structure. fadD32, pks13, accD4 along with two of the cmyts genes, belong to a cluster wich posseses a very conserved organization between Mycobacterium and Corynebacterium. This cluster is very likely involved in the envelope biosynthesis and some of its genes are under study.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Identification et caractérisation d'un locus génique de Corynebacterium glutamicum qui détermine une étape essentielle à la biosynthèse d'un lipoarabinomannane

Nous avons entrepris la construction de mutants du locus -pgsA-htrB-pimA des espèces C. glutamicum ATCCl3032 et Corynebacterium sp 2262 (reclassifiées comme C. glutamicum Or2262). Deux gènes de ce locus, pgsA et pimA sont, chez Mycobacterium tuberculosis, des gènes essentiels pour la survie, et impliqués dans la biosynthèse de lipoarabinoyl mannane (LAM), un important déterminant de pathogénicité de cet organisme. Nous avons réussi à construire des mutants htrB et pimA chez C. glutamicum. Ces mutants montrent une perméabilité altérée aux antibiotiques chloramphénicol, érythromycine, et kanamycine. Le mutant pimA de C. glutamicum Or2262 est dépourvu de LAM et des dérives mannosylés (PIMs) du phosphatidyl myo-inositol qui sont des précurseurs biosynthétiques obligés du LAM. Les effets de l'absence de pimA dans la perméabilité sont attribués au moins en partie - à la participation directe des PIMs et du LAM dans l'intégrité de la barrière de perméabilité de C. glutamicum. Nos tentatives de construction de mutants du gène pgsA ont été sans succès, en révélant néanmoins un aspect jusqu'alors inconnu de la recombinaison chez C. glutamicum.Mutants carrying insertions on the C. glutamicum genes pimA and htrB were constructed. These genes belong to a cluster that respectively present a strong homology to genes of the cluster Rv2612c, Rv2611c, and Rv2610c of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. The loci Rv2612c, and Rv2610c encode respectively for the essential proteins PgsA and PimA, involved in the biosynthesis of the envelope constituents: phosphatidyl , myo-inositol mannosides (PIMs), lipomannane (LM), and ultimately, of lipoarabinoyl mananne (LAM). The C. glutamicum mutants htrB (presumably encoding for an acyl transferase) and pimA (encoding for a glycosyl transferase) show an altered permeability to the antibiotics; the pimA mutant is also deficient for growth in glucose as unique carbon source. The pimA mutant is deficient in the synthesis of the corynebacterial forms of PIM and LAM, but make normal amounts of a compound undistinguishable of the corynebacterial form of LM. In mycobacteria LM is an obligate biosynthetic intermediary between PIM and LAM. We discuss the consequences of these findings in the rapidly evolving view of the Corynebacterial envelope.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

La réponse au stress chez Bacillus subtilis (signalisation, adaptation et rôle de la protéine L24)

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Influence sur la nitrification en bioréacteurs de la matière organique de rejets de la station d'épuration d'Achères (Paris)

[Departement_IRSTEA]GMA [TR1_IRSTEA]GMA3-Altérations physico-chimiques et biologiques des écosystèmes d'eau couranteThe Achères treatment station throws important quantities of organic and ammoniac matter into the Seine. The monitoring of the nitrifying activity, in reactors, of effluents from the station mixed with the Seine water, has shown that strong quantities of organic matter, such as the ones that can be observed at the time of low waters, do not delay the beginning of the nitrification and do not influence its duration. Furthermore, the more or less splitted sequencing of a same volume of discharges does not lead to a nitrification by stages, but only to a single stage beginning simultaneously whatever the sequence of studied supplies.La station d'épuration d'Achères rejette dans la Seine d'importantes quantités de matière organique et d'ammoniac. Le suivi de l'activité nitrifiante, en réacteur, des effluents de la station mélangés à l'eau de la Seine, a révélé que de fortes quantités de matière organique, telles qu'on peut en rencontrer lors de périodes d'étiage, ne retardent pas le début de la nitrification et n'ont pas d'influence sur sa durée. De plus, le séquençage plus ou moins fractionné d'un même volume de rejet ne conduit pas vers une nitrification par paliers, mais à une étape unique débutant simultanément quelle que soit la séquence des apports étudiés

Activité bactérienne hétérotrophe et nitrifiante dans les effluents rejetés par la station d'épuration d'Achères (Paris) : caractérisation de la fraction biodégradable

[Departement_IRSTEA]GMA [TR1_IRSTEA]GMA5-Epuration des eaux uséesInternational audienceDownstream from Paris, the river Seine is submitted to effluent discharged from the Achères treatment plant which deals 70% of the sewage from the Paris agglomeration. Bacterial concentration and organic matter in this treated effluent are respectively about 10^2 and 10 time more important than in the river upstream. The effluent flow-rate can represent 25% of the total flow water level of river Seine by dry weather. The object of this study was to determine if the bacteria from effluent are able to use organic matter of effluent and then to quantify the biodegradable fraction. We have shown that at least 65% of DOC in the Achères effluent was biodegradable (BDOC) during the time of experiment, which was longer than the water transit time in river Seine before reaching the estuary. Heterotrophic bacterial population can use this BDOC and about 47% of the fraction protein. The nitrifying process appears few days after heterotrophic bacterial activity. After 34 days, nitrite and nitrate amounts are higher than ammonium at t0.A l'aval de Paris, la Seine reçoit l'effluent de la station d'épuration d'Achères qui traite 70 % des eaux usées de l'agglomération parisienne. Les concentrations bactérienne et en matière organique dans ces effluents traités sont respectivement d'environ 10 ^ 2 et 10 fois plus importantes que dans la rivière en amont. Le débit de ces effluents peut représenter jusqu'à 25% du débit de la Seine par temps sec. L'objet de cette étude était de déterminer si les bactéries présentes dans l'effluent sont capables d'utiliser la matière organique des eaux épurées puis d'en quantifier la fraction biodégradable. Nous avons montré qu'au moins 65 % de COD des l'effluent d'Achères étaient biodégradables (CODB) pendant la durée de l'expérience, ce qui est plus long que le temps de transit de l'eau dans la Seine avant d'atteindre l'estuaire. La population bactérienne hétérotrophe peut utiliser cette CODB et environ 47% de la fraction protéique. Le processus de nitrification apparaît quelques jours après l'activité bactérienne hétérotrophe. Après 34 jours, les teneur en azote des nitrites et des nitrates sont supérieurs à celui de l'ammonium à t0