Vers l'étude de la spécificité d'enzymes de biosynthèse des HS (Développement de méthodologies pour la synthèse de fragments de structure bien définie)

Les Héparanes sulfates (HS) appartiennent à la famille des glycosaminoglycanes (GAGs) qui sont des polysaccharides existants sur la surface cellulaire ou dans la matrice extracellulaire des cellules animales. Les GAGs jouent des rôles essentiels dans plusieurs processus biologiques via leurs interactions avec certaines protéines (chemokines, cytokines, facteurs de croissance, enzymes ) dont ils modulent les activités biologiques. Ils sont constitués par la répétition d un motif disaccharidique de base comportant un acide uronique lié à un 2-amino-sucre. Une diversité moléculaire considérable provient de l existence de divers motifs de O-et/ou N-sulfatation ainsi que de motifs d épimérisation au niveau de l acide uronique. Cette diversité qui est responsable d interactions spécifiques de haute affinité avec différentes protéines serait due à l action des différentes enzymes de biosynthèse. Ce travail de thèse vise à développer de nouvelles méthodologies nécessaires à la préparation d une chimiothèque octasaccharidique de fragments d HS, dans le but d étudier la spécificité des enzymes de biosynthèse des HS et principalement la N-déacétylase N-sulfotransférase (NDST) et la C-5 épimérase. La chimiothèque octasaccharidique peut être obtenue à partir d un seul octasaccharide dont les quatre atomes d azote seraient protégés par des groupements protecteurs différents (octasaccharide N-différencié ). La synthèse de cet octasaccharide constitue notre objectif principal.Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l optimisation de la synthèse d une brique disaccharidique impliquée dans la synthèse des fragments d héparane sulfate. Dans cet objectif nous avons mis au point une méthode d acétylation sélective de l hydroxyle primaire, une méthode de benzylation compatible avec la présence à l acétate et une procédure one-pot comportant quatre étapes de synthèse du disaccharide et facilitant l accès au disaccharide avec 45 % de rendement global.Par la suite, nous avons optimisé la réaction de glycosylation entre les briques disaccharidiques en utilisant le donneur N-phényltrifluoroacétimidate, dans le but d avoir une stéréosélectivité a maximale et d améliorer le rendement de glycosylation. Les conditions optimisées ont permis l accès au tétrasaccharide et à l octasaccharide ayant les fonctions amines sous forme de groupements azido, avec un excellent rendement (95 %) et une bonne stéréosélectivité (96/4) en faveur de l anomère a et sont reproductibles à grande échelle. La troisième partie était consacrée à une étude méthodologique afin de permettre la synthèse de l octasaccharide N-différencié précurseur de la chimiothèque octasaccharidique. Dans ce but, nous avons choisi les groupements Fmoc, Alloc, pNZ et N3 comme groupements protecteurs des fonctions amines de l octasaccharide. Nous avons préparé différents accepteurs ayant les fonctions amines protégées avec ces groupements afin d étudier l influence des différents groupements N-protecteurs de la fonction amine de l accepteur sur la réaction de glycosylation. Les différents tétrasaccharides ont été obtenus avec d excellents rendements (87 97 %) et une bonne stéréosélectivité (autour de 95/5 en faveur de l anomère a). Enfin, nous avons effectué une étude de l orthogonalité de la déprotection de ces groupements protecteurs (N3, Alloc, Fmoc et pNZ). Cette étude est essentielle avant la préparation de l octasaccharide pour prouver la stratégie de la synthèse. En plus cette étude facilitera la préparation de la chimiothèque octasaccharidique une fois l octasaccharide N-différencié préparé.Heparan sulfate (HS), a highly sulfated glycosaminoglycan present in the extracellular matrix and at the cell surface, is known to play vital functional roles in various biological processes due to its interactions with proteins (chemokines, cytokines, growth factors, enzymes ...). HS consist of a repeating disaccharide unit, composed of a glucosamine and a hexuronic acid (glucuronic acid or its C5 epimer, iduronic acid).The HS chains are further modified by some epimerases and sulfotransferases during their biosynthesis. These sulfation/epimerization patterns provide considerable complexity. These modifications are required for interaction with many protein ligands.This thesis aims to develop new methodologies for the preparation of a library of octasaccharides, HS fragments, in order to study the specificity of HS biosynthesis enzymes, mainly N-deacetylase N-sulfotransferase (NDST) and the C-5 epimerase. The library can be obtained starting from a single octasaccharide whose four nitrogen atoms are protected by various protecting groups (octasaccharide N-differentiated). The synthesis of this octasaccharide is our main goal.We are interested in first to optimize the synthesis of a fully protected disaccharide which is used as building block in our heparan sulfate fragments synthesis. For this purpose we have developed a regioselective acetylation method of a disaccharide bearing three hydroxyl groups using a temporary protection, a benzylation method compatible with the presence of one acetate group using silver oxide and a one-pot procedure incorporating up to four steps, reducing work-up and time-consuming purifications. In the second chapter, we optimized the glycosylation reaction between two disaccharides using the N- phényltrifluoroacétimidate donor in order to have good a stereoselectivity and yield. We are now able to obtain the tetrasaccharide and the octasaccharide with 95 % yield and (a/b : 96/4) stereoselectivity.The third part was devoted to the methodological study to obtain the N-differentiated octasaccharide, precursor of a octasaccharides library. For this purpose, we chose Fmoc, Alloc, pNZ and N3 as protecting groups of the amine groups. We have prepared various acceptors with these different protecting groups in order to study them in glycosylation reactions. The tetrasaccharides were obtained with excellent yields (87-97%) and good stereoselectivity (around 95/5 for the a anomer) with the four protecting groups. Finally, we conducted a study to deprotect these protecting groups (N3, Alloc, Fmoc and pNZ) on the tetrasaccharides. This study is essential before preparing the octasaccharide as a proof of the synthesis strategy. In addition this study will facilitate the preparation of the octasaccharides library once the N-differentiated octasaccharide prepared.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Synthèse chimio-enzymatique d'oligosaccharides sur support soluble dendrimérique

Alors que l'importance biologique des protéines et des acides nucléiques est connue depuis longtemps, c'est seulement depuis quelques années que l'on a pris conscience de l'importance des sucres dans de nombreux phénomènes biologiques. Cependant, le problème majeur qui empêche le développement rapide de la glycobiologie se situe dans le manque de sucres complexes parfaitement purs et structurellement définis. Pour circonvenir à ce problème, nous avons décidé de combiner les avantages de la synthèse supportée avec ceux de l'utilisation d'enzymes. Lors de telles synthèses chimio-enzymatiques, deux méthodes sont envisageables : soit l'oligosaccharide est bâti brique par brique sur le support, grâce à l'utilisation successive de glycosyltransférases ; soit le substrat donneur est accroché au support et l'oligosaccharide accepteur présent en solution est ensuite greffé sur le support par l'action d'une glycosyltransférase. C'est cette seconde approche que nous avons voulu mettre au point, en synthétisant un nucléotide sucre supporté, le GDP-fucose, substrat des fucosyltransférases. Pour cela, après avoir prouvé la viabilité de la synthèse sur des composés modèles, nous avons fonctionnalisé et caractérisé un nouveau support soluble dendrimérique issu du poly(éthylène glycol). Ce dernier nous a permis, après greffage d'un synthon issu du L-galactose, de mettre au point la synthèse supportée du GDP-fucose, obtenu avec un rendement global de 37% sur les 8 étapes chimiques. Ensuite, notre nucléotide sucre supporté a été utilisé comme substrat donneur de la fucosyltransférase 3 et nous a permis d'obtenir, après coupure au borure de nickel, un dérivé fluorescent du trisaccharide Lewis [a]. Ce travail constitue l'une des premières véritables synthèses chimio-enzymatiques supportées d'oligosaccharides et permet d'envisager la synthèse de nombreux autres oligosaccharides, en utilisant notre GDP-fucose supporté.Although the biological importance of proteins and nucleic acids has long been known, it is only in recent years that scientists have realised the importance of sugars in many biological processes. Today, the major drawback, which is stopping the fast development of glycobiology, remains the lack of complex sugars perfectly pure and well characterised. To address this problem, we decided to combine the advantages of a supported synthesis with the use of enzymes. During such chemo-enzymatic syntheses, two methodologies may be used : either the oligosaccharide is made step by step on the support, using successive glycosyltransferases ; or the donor substrate is bound to the support and the acceptor, present in solution, is subsequently coupled to the support using a glycosyltransferase. Using the latter method, we synthesised a supported nucleotide sugar, GDP-fucose, a substrate of fucosyltransferases. To achieve this, after having proved the viability of the synthesis on model compounds, we functionalised and characterised a new soluble and dendrimeric support, a derivative of poly(ethylene glycol). This ultimately allowed us, after the binding of a synthon from L-galactose, to do the supported synthesis of GDP-fucose, which was obtained with a global yield of 37% after 8 chemical steps. Subsequently, our supported nucleotide sugar was used as a dollar substrate of fucosyltransferase 3 and gave us, after cleavage using nickel boride, a fluorescent derivative of the trisaccharide Lewis [a]. This work represents one of the first real chemo-enzymatic supported syntheses of an oligosaccharide and provides a future basis for many other oligosaccharide syntheses using our supported GDP-fucose.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Méthodologies de synthèse et de fonctionnalisation de fragments de Glycosaminoglycanes

Les Glycosaminoglycanes (GAGs) sont des molécules linéaires sulfatées présentant un motif disaccharidique de base répétitif contenant toujours un acide uronique ou une hexosamine. Les chaînes de GAGs, liées le plus souvent par une liaison covanlente à une protéine transmembranaire. On les trouve aussi dans les tissus conjonctifs et dans la matrice extracelullaire. Elles présentent de nombreuses interactions avec des protéines de façon très différentes. Leurs très grandes diversités moléculaires leur permet d interagir de manière souvent spécifique avec de nombraueses protéines. Cette thèse concentre tout d abord à la synthèse d un disaccharide de base dans l approche 2 + 2 de synthèse de fragments de HP/HS, à partir de produits commerciaux : le D-glucosamine et le diacétone-D-glucose. Nous avons trouvé une méthode efficace de désacétylation sélective anomérique en utilisant le triflate de néodymium. Cette méthode non seulement permet la désacétylation sélective en position anomérique sur le composé méthyl 1,2,4-tri-O-acétyle-3-O-benzyle- -D-idopyranuronate avec un excellent rendement 96%, étape clé dans la stratégie de synthèse de la brique L-iduronique, mais aussi est appliquée sur différents sucres peracétylés avec de bons résultats. De plus, c est une méthode verte car les catalyseurs utilisés ne sont pas toxiques et peuvent être recyclés trois fois sans perte d activité. Nous avons aussi trouvé une méthode efficace de fonctionnalisation du groupement allyle par couplage radicalaire allyle-thiols en utilisant le triéthylborane comme initiateur. Un thiol contenant l amine masquée a été préparé avec 76% de rendement en 4 étapes à partir du chlorhydrate de 3-chloropropylamine commercial. Le couplage radicalaire entre ce bras et des allyles glycosides (mono-, di-, tétrasaccharides) contenant différents groupes protecteurs a été efficacement effectué en ajoutant le catéchol dans le milieu réactionnel. Nous avons aussi montré que cette méthode fonctionne bien dans l eau avec de bons rendements sur un produit libre et un produit sulfatéGlycosaminoglycans are of critical importance in intercellularcommunication in organisms. This ubiquitous class of linearpolyanions interacts with a wide variety of proteins, includinggrowth factors and chemokines, which regulate important physiologicalprocesses. The presence of glycosaminoglycans on cellmembranes and in the extracellular matrix also has resulted in theirexploitation by infectious pathogens to gain access and entry intoanimal cells. This thesis focus firstly on the synthesis of a repetive disaccharide of Heparin sulphate (HP) from available commercially compounds: D-acetoneglucose and D-glucosamine. We have disclosed a method of selective deacetylation in anomeric position using the Neodymium triflate (Nd(OTf)3. This method allow not only the anomeric selective deacetylation of compound Methyl 1,2,4-tri-O-acetyl-3-O-benzyl- -D-idopyranuronate in excellent yield 96%, key step in th synthesis of L-iduronic building bloc, but also to be applied on diffirent peracetylated sugars in good results. Moreover, this method can be classed in the green chemistry. We have also found a efficient method to functionise the allyl group by radical coupling allyl-thiol using the triethylboran as catalyst. A thiol linker containing a protected amine was prepared with overall yield of 76% in 4 steps from chlorohydrated 3-chloropropylamine. The radical coupling between this linker and the allyl glyosides (mono-, di-, tetrasaccharides) containing the variable protecting groups was efffiently carried out adding the catechol. This method functionise in good yields in water on free and sulphated.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Étude par spectroscopie infrarouge des hydrogéno et deutériocarbonates de rubidium et de césium et des sesquicarbonates de potassium et de rubidium

Les spectres infrarouges des composés RbHCO3, RbDCO3, CsHCO3 et CsDCO3 sont enregistrés entre 4 000 et 625 cm–1 à 20°C et à — 180°C. On propose une attribution des bandes, par analogie avec l’hydrogénocarbonate de potassium. Dans ces sels, les ions HCO3– forment des dimères fermés (HCO3)22–. Les sels K2CO3, KHCO3, 2H2O et Rb2CO3, RbHCO3, 2 H2O ont été préparés : leurs spectres infrarouges, interprétés par analogie avec celui du sesquicarbonate de sodium, suggèrent l’existence d’ions (CO3HCO3)3–

Chondroitin-4-O-sulfatase from Bacteroides thetaiotaomicron: exploration of the substrate specificity

Bacterial sulfatases can be good tools to increase the molecular diversity of glycosaminoglycan synthetic fragments. A chondroitin 4-O-sulfatase from the human commensal bacterium Bacteroides thetaiotaomicron has recently been identified and expressed. In order to use this enzyme for synthetic purposes, the minimal structure required for its activity has been determined. For that, four 4-O-sulfated monosaccharides and one 4-O-sulfated disaccharide have been synthesized and used as substrates with the sulfatase. The minimum structure was shown to be a disaccharide but in contrast to the natural substrate, which must have a 4,5-insaturation, the enzyme accepts as substrate, a disaccharide with a saturated glucuronic acid at the non-reducing end and even a glucopyranosyl moiety without the carboxylic acid functionality. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved

Étude comparée par spectroscopie infrarouge des caractères donneur et accepteur de proton de la diphénylcétimine

Les constantes d'association de la diphénylcétimine évaluées ici avec le diméthylsulfoxyde, l'hexaméthylphosphorotria mide, le trifluoroéthanol et le parachlorophénol dans le tétrachlorure de carbone à 25 °C environ, permettent de comparer le pouvoir donneur ou accepteur de proton de cette imine à celui d'autres composés. En outre, on peut interpréter l'autoassociation de la diphénylcétimine en solution dans le tétrachlorure de carbone au moyen du modèle de COGGESHALL et SAÏER jusqu'à 2,5 M

Syntheses and structural studies of several group 8 metal complexes derived from 1,3-butadiyne

As part of an extensive investigation into the chemistry of complexes containing metal-ligand centers linked by chains of C(sp) atoms, the preparation, characterization, and single-crystal X-ray diffraction molecular structure determinations of four complexes {MLn}-C≡CC≡C-{M′L′m} [MLn = Ru(dppe)Cp*, M′L′m = Fe(dppp)Cp* (1), Ru(dppe)Cp* (2), MLn = M′L′m = Os(PPh3)2Cp (3)], and {Cp*(dppe)Ru}C≡CC≡C{trans-RuCl(dppe)2} (4), in which the alternating C(sp)–C(sp) bonds have values between 1.375 and 1.40 Å (single) and between 1.20 and 1.259 Å (triple), respectively, are described. In addition, a structure determination of Ru3(μ-H){μ3-C2C≡C[Ru(PPh3)2Cp]}(CO)9 (5) shows that the C2 fragment attached to the HRu3 cluster shows the expected lengthening [to 1.311(7) Å] and bending at the two carbon atoms [to 152.6(6) and 157.6(5)°] (resulting from back-bonding from the Ru3 cluster into the C≡C π* orbitals) compared with the essentially linear Ru–CC– moiety [C≡C 1.222(6) Å, angles at C of 178.0(5), 172.3(6)°],Michael I. Bruce, Marcus L. Cole, Karine Costuas, Benjamin G. Ellis, Kathy A. Kramarczuk, Claude Lapinte, Brian K. Nicholson, Gary J. Perkins, Brian W. Skelton, Allan H. White and Natasha N. Zaitsev