Papel de los receptores P2x7 y P2Y₂ en el procesamiento de la APP dependiente de alfasecretasa: control de la formación de placas amiloides "in vivo" por el receptor P2X7

El ATP ejerce funciones fundamentales a nivel extracelular en numerosos procesos biológicos a través de la activación de los receptores purinérgicos P2X y/o P2Y. Una de las características patológicas de la enfermedad de Alzheimer es la aparición de placas neuríticas extracelulares, que son depósitos de péptidos β-amiloide (Aβ). Estos péptidos se producen por la escisión proteolítica de la proteína precursora de amiloide APP. Objetivos Dado que los receptores purinérgicos están involucrados en numerosos procesos neurológicos, intentamos dilucidar si podrían desempeñar un papel en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. Específicamente, en el procesamiento de APP, un paso clave en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA). Resultados Se ha estudiado el efecto de la activación del receptor P2X7 sobre los niveles de α-CTF C83 utilizando células N2a como modelo. La estimulación de las células con el agonista de P2X7 BzATP llevó a una reducción de los niveles de C83 después de 2 y 4 horas de incubación. Esta disminución en los niveles de C83 se debió a la activación de un receptor tipo P2X7, ya que la presencia del antagonista de P2X7 BBG revirtió el efecto inhibitorio del BzATP..

Functional characterization of P2Y1 and P2X4 receptors in human neuroblastoma SK-N-MC cells

Nucleotides are important signalling molecules in both the peripheral and central nervous system. However, the in vitro study of their receptors can be hampered by the heterogeneity of primary neuronal cultures. The use of clonal neuroblastoma cell lines allows to circumvent this difficulty, so these lines are often used as a model to analyze the properties, regulation and physiological role of nucleotide receptors in neural tissues. Expression studies indicated the presence of P2Y1, P2Y6, P2Y11, P2Y13, P2X1, P2X4, P2X5, P2X6 and P2X7 proteins in SK-N-MC cells. Functional analyses showed transient [Ca2+]i increases upon application of ADP, 2-MeSADP or ADPβS. Responses to these agonists seem to be mediated by a P2Y1 receptor, as demonstrated by the almost complete blockade exerted by the P2Y1-selective antagonist MRS2179. ATP was also able to induce [Ca2+]i increases in SK-N-MC cells. Responses to ATP were partially blocked by MRS2179 and the P2X antagonist TNP-ATP, thus suggesting that ATP can interact with two different P2 receptors: a P2Y1 receptor, inhibited by MRS2179, and a TNP-ATP sensitive P2X receptor. To characterize the P2X receptor responsible for the MRS2179-resistant component of the ATP response, we analyze the effect of several P2X agonists on [Ca2+]i. Cells did not show responses to either α,β-meATP or BzATP, although [Ca2+]i increases could be observed when cells were challenged with CTP. Both the response to CTP and the MRS2179-resistant component of ATP response were potentiated by ivermectin. Such pharmacological profile is consistent with the presence of a functional P2X4 receptor in SK-N-MC cell lineLos nucleótidos son importantes moléculas señalizadoras en el sistema nervioso. El estudio in vitro de sus receptores puede verse obstaculizado por la heterogeneidad de los cultivos neuronales. El uso de líneas celulares de neuroblastoma permite eludir esta dificultad y dichas líneas se utilizan frecuentemente como un modelo con el que analizar las propiedades, regulación y función de los receptores de nucleótidos en tejidos neurales. Estudios de expresión indicaron la presencia de proteínas P2Y1, P2Y6, P2Y11, P2Y13, P2X1, P2X4, P2X5, P2X6 y P2X7 en las células SK-N-MC. Análisis funcionales mostraron incrementos transitorios de [Ca2+]i tras la aplicación de ADP, 2- MeSADP o ADPβS, respuestas que parecen estar mediadas a través un receptor P2Y1, como se pone de manifiesto por el bloqueo casi total ejercido por el antagonista selectivo P2Y1, MRS2179. El ATP también indujo incrementos de [Ca2+]i en las células SK-N-MC, siendo su respuesta parcialmente bloqueada por MRS2179 y por el antagonista P2X TNP-ATP, lo que sugiere que el ATP puede interactuar con dos receptores P2 diferentes: un receptor P2Y1, inhibido por MRS2179, y un receptor P2X sensible a TNP-ATP. Se caracterizó el receptor P2X analizando el efecto de varios agonistas en la [Ca2+]i. Ninguna célula mostró respuestas a αβ- meATP o BzATP, aunque se observaron incrementos de [Ca2+]i cuando las células fueron estimuladas con CTP. Tanto la respuesta a CTP como el componente de la respuesta a ATP resistente a MRS2179, se potenciaron en presencia de ivermectina. Todos estos datos sugieren la presencia de un receptor P2X4 funcional en las células SK-N-MCThis work was supported by research grants from Ministerio de Ciencia e Innovación (BFU2014-53654-P) and Comunidad de Madrid (S2013/ICE-2958 BRADECM

Caracterización funcional de receptores P2Y1 y P2X4 en células SK-N-MC de neuroblastoma humano

Los nucleótidos son importantes moléculas señalizadoras en el sistema nervioso. El estudio in vitro de sus receptores puede verse obstaculizado por la heterogeneidad de los cultivos neuronales. El uso de líneas celulares de neuroblastoma permite eludir esta dificultad y dichas líneas se utilizan frecuentemente como un modelo con el que analizar las propiedades, regulación y función de los receptores de nucleótidos en tejidos neurales.Estudios de expresión indicaron la presencia de proteínas P2Y1, P2Y6, P2Y11, P2Y13, P2X1, P2X4, P2X5, P2X6 y P2X7 en las células SK-N-MC. Análisis funcionales mostraron incrementos transitorios de [Ca2+]i tras la aplicación de ADP, 2-MeSADP o ADPβS, respuestas que parecen estar mediadas a través un receptor P2Y1, como se pone de manifiesto por el bloqueo casi total ejercido por el antagonista selectivo P2Y1, MRS2179. El ATP también indujo incrementos de [Ca2+]i en las células SK-N-MC, siendo su respuesta parcialmente bloqueada por MRS2179 y por el antagonista P2X TNP-ATP, lo que sugiere que el ATP puede interactuar con dos receptores P2 diferentes: un receptor P2Y1, inhibido por MRS2179, y un receptor P2X sensible a TNP-ATP. Se caracterizó el receptor P2X analizando el efecto de varios agonistas en la [Ca2+]i. Ninguna célula mostró respuestas a α,β-meATP o BzATP, aunque se observaron incrementos de [Ca2+]i cuando las células fueron estimuladas con CTP. Tanto la respuesta a CTP como el componente de la respuesta a ATP resistente a MRS2179, se potenciaron en presencia de ivermectina. Todos estos datos sugieren la presencia de un receptor P2X4 funcional en las células SK-N-MC

Papel fisiológico de los nucleótidos extracelulares en el sistema nervioso central: señalización vía receptores P2X y P2Y

In the last few years nucleotide receptors, the ionotropic P2X1-7 subunits and the metabotropic P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, have acquired an excepcional importance due to their strategic location in organs and tissues, their great variety along with the complexity of the associated signalling pathways and the first evidence of the serious alterations entailed in their dysfunctions. Our group has been pioneer in the characterization of these receptors in the nervous system, where we defined their location and functionality. The abundant presence, at a presynaptic level, of P2X3 and P2X7 should be emphasized, where by means of calcium intake they induce neurotransmitter exocytosis, such as glutamate, GABA, catecholamines and acetylcholine among others, as described in previous works by our group. In addition, they induce an extensive remodeling of the terminal’s cytoskeleton and exocytotic mechanisms through CaMKII and they can interact widely with other ionotropic and metabotropic receptors co-existing in nearby areas. Neural cells also exhibit the presence of most P2Y receptors signalling through a large variety of intracellular cascades. Recently we have demostrated that P2Y metabotropic receptors of the sub-family activated by ADP, especially P2Y13, are connected with the signalling towards GSK3 and â-catenin, opening new ways of understading the nucleotide function in survival and maintenance of neural cells. In addition both P2X and P2Y receptors play a role in early developmental stages and neural maturation where their function has to be fully understanded. Nucleotide receptors are also very abundant in glial cells, and our group has shown that most P2Y receptors are present and fully functional in cultured astrocytes, where, depending on the subtype receptor they activate a large variety of signalling cascades.En los ultimos anos los receptores de nucleotidos, receptores ionotropicos P2X1-7 y metabotropicos P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, han adquirido una importancia excepcional debido a su localizacion estrategica en organos y tejidos, a su gran variedad junto con la complejidad de vias de senalizacion a las que estan asociados y a las primeras evidencias de importantes alteraciones debidas a su mal funcionamiento. Nuestro grupo ha sido pionero en la caracterizacion estos receptores en el sistema nervioso, donde definimos su localizacion y su funcionalidad. La abundante presencia, a nivel presinaptico, de las subunidades P2X3 y P2X7 debe ser resaltada, donde gracias a la entrada de calcio inducen la exocitosis de varios neurotransmisores, como glutamato, GABA, catecolaminas y acetilcolina entre otros, como ha sido descrito por nuestro grupo en trabajos previos. Ademas, estos receptores inducen una profunda remodelacion del citoesqueleto de las terminales nerviosas y de los mecanismos exocitoticos a traves de la CaMKII y pueden interactuar con otros receptores ionotropicos y metabotropicos co-existentes en sus cercanias. La mayoria de los receptores P2Y tambien estan presentes en las celulas nerviosas, activando vias de senalizacion a traves de una gran variedad de cascadas intracelulares. Recientemente hemos demostrado que los receptores metabotropicos P2Y pertenecientes a la sub-familia de receptores activados por ADP, especialmente el P2Y13, estan conectados con la senalizacion hacia GSK3 y ƒÀ-catenina, lo que abre nuevas vias para la comprension de la funcion de los nucleotidos en la supervivencia y el mantenimiento de las celulas nerviosas. Ademas, tanto los receptores P2X como los P2Y juegan un papel en los estadios iniciales del desarrollo y en la maduracion neuronal donde su funcion aun ha de ser plenamente comprendida. Los receptores de nucleotidos son tambien muy abundantes en las celulas gliales, y nuestro grupo ha demostrado que la mayoría de los receptores P2Y están presentes y son plenamente funcionales en astrocitos en cultivo, donde, dependiendo del subtipo de receptor, activan una gran variedad de cascadas de señalización