70 research outputs found
Structure and primase-mediated activation of a bacterial dodecameric replicative helicase
International audienceReplicative helicases are essential ATPases that unwind DNA to initiate chromosomal replication. While bacterial replicative DnaB helicases are hexameric, Helicobacter pylori DnaB (HpDnaB) was found to form double hexamers, similar to some archaeal and eukaryotic replicative helicases. Here we present a structural and functional analysis of HpDnaB protein during primosome formation. The crystal structure of the HpDnaB at 6.7 Ëš A resolution reveals a dode-cameric organization consisting of two hexamers assembled via their N-terminal rings in a stack-twisted mode. Using fluorescence anisotropy we show that HpDnaB dodecamer interacts with single-stranded DNA in the presence of ATP but has a low DNA unwinding activity. Multi-angle light scattering and small angle X-ray scattering demonstrate that interaction with the DnaG primase helicase-binding domain dissociates the helicase dodecamer into single ringed primosomes. Functional assays on the proteins and associated complexes indicate that these single ringed primosomes are the most active form of the helicase for ATP hydrolysis, DNA binding and unwinding. These findings shed light onto an activation mechanism of HpDnaB by the primase that might be relevant in other bacteria and possibly other organisms exploiting dodecameric helicases for DNA replication
Performance of a Multiplex Serological Helicobacter pylori Assay on a Novel Microfluidic Assay Platform
International audienceInfection with Helicobacter pylori (H. pylori) occurs in 50% of the world population, and is associated with the development of ulcer and gastric cancer. Serological diagnostic tests indicate an H. pylori infection by detecting antibodies directed against H. pylori proteins. In addition to line blots, multiplex assay platforms provide smart solutions for the simultaneous analysis of antibody responses towards several H. pylori proteins. We used seven H. pylori proteins (FliD, gGT, GroEL, HpaA, CagA, VacA, and HP0231) and an H. pylori lysate for the development of a multiplex serological assay on a novel microfluidic platform. The reaction limited binding regime in the microfluidic channels allows for a short incubation time of 35 min. The developed assay showed very high sensitivity (99%) and specificity (100%). Besides sensitivity and specificity, the technical validation (intra-assay CV = 3.7 ± 1.2% and inter-assay CV = 5.5 ± 1.2%) demonstrates that our assay is also a robust tool for the analysis of the H. pylori-specific antibody response. The integration of the virulence factors CagA and VacA allow for the assessment of the risk for gastric cancer development. The short assay time and the performance of the platform shows the potential for implementation of such assays in a clinical setting
Integrin but not CEACAM receptors are dispensable for Helicobacter pylori CagA translocation
Translocation of the Helicobacter pylori (Hp) cytotoxin-associated gene A (CagA) effector protein via the cag-Type IV Secretion System (cag-T4SS) into host cells is a hallmark of infection with Hp and a major risk factor for severe gastric diseases, including gastric cancer. To mediate the injection of CagA, Hp uses a membrane-embedded syringe-like molecular apparatus extended by an external pilus-like rod structure that binds host cell surface integrin heterodimers. It is still largely unclear how the interaction of the cag-T4SS finally mediates translocation of the CagA protein into the cell cytoplasm. Recently certain carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs), acting as receptor for the Hp outer membrane adhesin HopQ, have been identified to be involved in the process of CagA host cell injection. Here, we applied the CRISPR/Cas9-knockout technology to generate defined human gastric AGS and KatoIII integrin knockout cell lines. Although confocal laser scanning microscopy revealed a co-localization of Hp and beta 1 integrin heterodimers on gastric epithelial cells, Hp infection studies using the quantitative and highly sensitive Hp beta-lactamase reporter system clearly show that neither beta 1 integrin heterodimers (alpha 1 beta 1, alpha 2 beta 1 or alpha 5 beta 1), nor any other a beta integrin heterodimers on the cell surface are essential for CagA translocation. In contrast, deletion of the HopQ adhesin in Hp, or the simultaneous knockout of the receptors CEACAM1, CEACAM5 and CEACAM6 in KatoIII cells abolished CagA injection nearly completely, although bacterial binding was only reduced to 50%. These data provide genetic evidence that the cag-T4SS-mediated interaction of Hp with cell surface integrins on human gastric epithelial cells is not essential for CagA translocation, but interaction of Hp with CEACAM receptors is facilitating CagA translocation by the cag-T4SS of this important microbe
Designed Ankyrin Repeat Proteins provide insights into the structure and function of CagI and are potent inhibitors of CagA translocation by the Helicobacter pylori type IV secretion system
The bacterial human pathogen Helicobacter pylori produces a type IV secretion system ( cag T4SS) to inject the oncoprotein CagA into gastric cells. The cag T4SS external pilus mediates attachment of the apparatus to the target cell and the delivery of CagA. While the composition of the pilus is unclear, CagI is present at the surface of the bacterium and required for pilus formation. Here, we have investigated the properties of CagI by an integrative structural biology approach. Using Alpha Fold 2 and Small Angle X-ray scattering, it was found that CagI forms elongated dimers mediated by rod-shape N-terminal domains (CagI N ) prolonged by globular C-terminal domains (CagI C ). Three Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) K2, K5 and K8 selected against CagI interacted with CagI C with subnanomolar affinities. The crystal structures of the CagI:K2 and CagI:K5 complexes were solved and identified the interfaces between the molecules, thereby providing a structural explanation for the difference in affinity between the two binders. Purified CagI and CagI C were found to interact with adenocarcinoma gastric (AGS) cells, induced cell spreading and the interaction was inhibited by K2. The same DARPin inhibited CagA translocation by up to 65% in AGS cells while inhibition levels were 40% and 30% with K8 and K5, respectively. Our study suggests that CagI C plays a key role in cag T4SS-mediated CagA translocation and that DARPins targeting CagI represent potent inhibitors of the cag T4SS, a crucial risk factor for gastric cancer development.Bases structurale du système de secretion de type IV d'Helicobacter pyloriBases structurales et moléculaires de l'exploitation de l'integrin a5ß1 par le système de sécrétion de type IV d'Helicobacter pylor
Helicobacter pylori Type IV Secretion Apparatus Exploits β1 Integrin in a Novel RGD-Independent Manner
Translocation of the Helicobacter pylori (Hp) cytotoxin-associated gene A (CagA) effector protein via the cag-Type IV Secretion System (T4SS) into host cells is a major risk factor for severe gastric diseases, including gastric cancer. However, the mechanism of translocation and the requirements from the host cell for that event are not well understood. The T4SS consists of inner- and outer membrane-spanning Cag protein complexes and a surface-located pilus. Previously an arginine-glycine-aspartate (RGD)-dependent typical integrin/ligand type interaction of CagL with α5β1 integrin was reported to be essential for CagA translocation. Here we report a specific binding of the T4SS-pilus-associated components CagY and the effector protein CagA to the host cell β1 Integrin receptor. Surface plasmon resonance measurements revealed that CagA binding to α5β1 integrin is rather strong (dissociation constant, KD of 0.15 nM), in comparison to the reported RGD-dependent integrin/fibronectin interaction (KD of 15 nM). For CagA translocation the extracellular part of the β1 integrin subunit is necessary, but not its cytoplasmic domain, nor downstream signalling via integrin-linked kinase. A set of β1 integrin-specific monoclonal antibodies directed against various defined β1 integrin epitopes, such as the PSI, the I-like, the EGF or the β-tail domain, were unable to interfere with CagA translocation. However, a specific antibody (9EG7), which stabilises the open active conformation of β1 integrin heterodimers, efficiently blocked CagA translocation. Our data support a novel model in which the cag-T4SS exploits the β1 integrin receptor by an RGD-independent interaction that involves a conformational switch from the open (extended) to the closed (bent) conformation, to initiate effector protein translocation
Identification, structure and mode of action of a new regulator of the Helicobacter pylori HP0525 ATPase
Rôle des protéines structurales du virus de l'enroulement de la pomme de terre (PLRV) dans la transmission par son puceron vecteur Myzus Persicae
Diplôme : Dr. d'UniversiteL'agent de la maladie de l'enroulement de la pomme de terre est un virus à ARN simple brin de polarité positive, le Potato leafroll virus (PLRV). Ce travail de thèse a été consacré à la recherche du rôle des protéines structurales du PLRV durant la transmission par la comparaison des relations entre PLRV-14.2 et -CU87 et les différents clones de pucerons. Nous avons tout d'abord montré que les clones de pucerons utilisés appartiennent à différents taxons au sein du complexe d'espèce M. persicae. Ainsi, les clones M. antirrhinii sont de faibles vecteurs, les clones M. nicotianae sont des vecteurs efficaces et les clones de M. persicae ont des capacités vectrices variables. Nous avons ensuite mis en évidence que la souche PLRV-14.2 est capable de traverser efficacement les membranes des glandes salivaires des clones bon et mauvais vecteurs et d'initier une infection dans les plantes inoculées. Ceci montre le rôle régulateur de la membrane intestinale de M. persicae dans la transmission du PLRV. De plus, le PLRV-14.2 diffère des autres souches par une douzaine de changements dans la séquence de ses protéines structurales. Un ou plusieurs de ces changements sont probablement impliqués dans le phénotype faiblement transmissible de PLRV-14.2. Pour les identifier, les gènes, fragments de gènes ou mutations de PLRV-14.2 ont été insérés dans le clone ADNc infectieux d'une souche transmissible. Toutefois, le remplacement des gènes structuraux du clone infectieux par ceux de PLRV-14.2 réduit considérablement le caractère infectieux de l'ADNc, ce qui ne permet pas de conclure sur l'effet de ce remplacement sur la transmission par pucerons. En revanche, l'introduction dans l'ADNc du motif RS, situé en région N terminale de la RTP abolit la transmission ce qui suggère son implication dans le phénotype de PLRV-14.2. De plus, la localisation de l'un des deux changements intervenant sur la CP de PLRV-14.2 a été déterminée après modélisation de la structure 3D de la CP par homologie de séquence. Les résultats suggèrent que ce changement ne peut pas être impliqué dans une interaction avec un récepteur aphidien. La transmission étant dépendante des interactions entre virus et pucerons, nous avons ensuite comparé, par far-western blot, les protéines aphidiennes ayant une affinité pour les particules de PLRV-14.2 et PLRV-CU87. De nombreuses protéines aphidiennes (de 10 à 90 kDa) sur lesquelles s'attachent les particules virales des deux isolats ont été mises en évidence. De manière intéressante, parmi ces protéines, une protéine de 59 kDa est également détectée en utilisant des extraits protéiques d'intestin. Par ailleurs, l'étude des propriétés biochimiques des purifications virales n'a révélé aucune différence de taille ni de glycosylation entre les protéines structurales de PLRV-14.2 et PLRV-CU87. Par ailleurs, cette analyse a montré qu'une protéine de la plante (90 kDa) co-purifie avec le virus et que cette protéine est glycosylée. L'ensemble de ces travaux suggère de nouvelles hypothèses sur le rôle des protéines structurales du PLRV durant le passage de la membrane intestinale du puceron vecteur. La plus simple est que le processus aboutissant à l'endocytose des particules virales au niveau de la membrane intestinale se ferait en deux étapes faisant intervenir séquentiellement la RTP puis la CP. Alternativement, le passage de la membrane intestinale pourrait dépendre également d'autres protéines telles que la P90 que nous avons mise en évidence dans les purifications de virus. Enfin, contrairement à ce qui est admis, le puceron pourrait ne pas être un transporteur passif
Etudes structurales de facteurs de virulence de la bactérie Helicobacter pylori
Helicobacter pylori est une bactérie qui infecte l'estomac de la moitié de la population mondiale et est implquée dans la plupart des maladies gastriques, dont les ulcères et le cancer de l'estomac. La bactérie produit deux toxines, CagA et Tipa, qui sont associées avec le développement du cancer. CagA est injectée dans les cellules et interagit avec de nombreuses protéines des voies de signalisation cellulaire. Tipa est secrétée et internalisée dans les cellules gastriques où elle induit la production de cytokines pro-inflammatoires. Dans ce travail de thèse, nous avons tout d'abord étudié les interactions entre un domaine central de CagA et des protéines de H. pylori. Nous avons ensuite identifié de nouveaux fragments solubles de CagA par une méthodologie à "haut-débit". L'un d'eux, correspondant à l'extrémité C-terminale de la protéine de 33kDa, CagA(C33), a été caractérisé par différentes techniques de biochimie et de biophysique. CagA(C33) forme des dimères de dimères en solution et des particules en microscopie électronique. De plus, CagA(C33) peut être phosphorylé in vitro par les kinases c-Src et c-Abl mais l'efficacité de la phosphorylation dépend de la kinase utilisée. L'étude de l'interaction entre la phosphatase SHP-2 et CagA(C33) montre que CagA est dephosphorylée in vitro. Par ailleurs, les structures de deux formes cristallines de Tipa ont été déterminées par cristallographie aux rayons X. La structure du monomère de Tipa adopte un nouveau repliement, et la protéine forme des dimères différents dans les deux formes cristallines. L'étude de la protéine en solution indique qu'un des dimères est sans doute favorisé et suggère que les ponts disulfures identifiés en N-terminal ont un rôle durant la sécrétion de la protéine.H. pylori is a bacterium that infects the stomach of half of the world population. It is involved in most gastric diseases, in particular ulcers and the stomach cancer. The bacterium produces two toxins, CagA and Tipa, that associate with gastric cancer development. CagA is injected inside the cells and interacts with several proteins from signaling pathways. Tipa is secreted by H. pylori and internalized by the gastric cells, where it induces the production of proinflammatory cytokines. In this thesis, we have first studied the interactions between a central domain of CagA and proteins from H. pylori. We have then used a novel High-Throughput methodology to determine new soluble CagA fragments. One of them, corresponding to a C-terminal domain of 33kDa (CagA(C33)), has been characterized by using biochemical and biophysical techniques. CagA(C33) forms a dimer of dimers in solution and particles in eletron microscopy. Moreover, CagA(C33) can be phosphorylated in vitro by the c-Src and c-Abl kinases, but the phosphorylation efficiency depends on the kinase. The study of the interaction between P-CagA and the SHP-2 phosphatase shows that CagA is dephosphorylated in vitro. We have also solved the structures of two crystal forms of Tipa by X-ray crystallography. The structure of Tipa monomer adopts a novel fold and the protein forms different dimers in the two ccrystal forms. The study of Tipa in solution indicates that one of the crystallographic dimers is likely favored and suggests that the disulfide bridges identified in the N-terminal portion of the protein have a role during the secretion.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF
Rôle de protéines structurales du virus de l'enroulement de la pomme de terre (PLRV) dans la transmission pour son puceron vecteur Myzus mersicae
RENNES-Agrocampus-CRD (352382323) / SudocSudocFranceF
La transmission des virus de Solanacées par les pucerons
National audienceRevue de connaissance acquises au cours des 10 dernières années sur la transmission des virus des Solanacées par les pucerons. Le PVY et le PLRV, dont les modes de transmission sont sans nul doute les plus répandus et les mieux cernés, ont été choisis comme exemples
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