Salmonella enterica serovar Typhimurium genetic variants isolated after lethal treatment with Thymbra capitata essential oil (TCO) showed increased resistance to TCO in milk

The high prevalence of Salmonella enterica in milk poses a risk of considerable concern in the preservation of certain dairy products, mainly those elaborated from raw milk. Essential oils (EOs) have been proposed as a promising food preservative for such products due to their strong antimicrobial properties. Additionally, these natural antimicrobials have been shown to be effective against multi-drug resistant strains. They can thus also be utilized to prevent the dissemination of antimicrobial resistances (AMR). However, recent evidence of the development of bacterial resistance under EO treatments may call their use into question. This study sought to assess the emergence of antimicrobial resistant genetic variants of S. enterica serovar Typhimurium from survivors after cyclic exposure to lethal doses (>5 log10 cycles of inactivation) of Thymbra capitata EO (TCO), in order to evaluate the impact that it could have on milk preservation, to ascertain whether cross-resistance to antibiotics occurs, and to identify the genomic changes responsible for their phenotype. Isolated strains by TCO (SeTCO) showed a two-fold increase in minimum inhibitory and bactericide concentrations (MIC and MBC) of TCO compared to Salmonella enterica serovar Typhimurium wild-type strain (SeWT) in laboratory growth medium, as well as a greater adaptation and growth rate in the presence of the EOs and a higher survival to TCO treatments in buffers of pH 4.0 and 7.0. The increased resistance of SeTCO was confirmed in skimmed milk: 300 μL/L TCO reduced only 1 log10 cycle of SeTCO population, whereas it inactivated more than 5 log10 cycles in SeWT. Moreover, SeTCO showed an increased cross-resistance against aminoglycosides, quinolones and tetracyclines. Whole genome sequencing revealed 5 mutations in SeTCO: 2 in genes involved in O-antigens synthesis (rfbV and rfbX), 2 in genes related to adaptation to the growing medium (trkA and glpK), and 1 in a redox-sensitive transcriptional regulator (soxR). The phenotypic characterization of a constructed SeWT strain with mutant soxRSeTCO demonstrated that the mutation of soxR was the main cause of the increased resistance and tolerance observed in SeTCO against TCO and antibiotics. The emergence of resistant strains against EOs might jeopardize their use as food preservatives. Further studies will thus be required to determine under which conditions such resistant strains might occur, and to assess the food risk they may pose, as well as to ascertain their impact on the spread of AMR

Obtención y caracterización de proteínas Fur de microorganismos de interés biotecnológico y sanitario

Fur (Ferric uptake regulator) es un regulador global responsable de mantener la homeostasis del hierro en la mayor parte de procariotas. En muchos patógenos, Fur es esencial para la expresión de factores de virulencia y la colonización de los tejidos infectados, por lo que Fur se considera una prometedora futura diana en la búsqueda de nuevos fármacos. En este trabajo se ha llevado a cabo el clonaje de las proteínas Fur de Legionella pneumophila y Staphylococcus aureus en un vector de expresión, se han sobreexpresado en Escherichia coli y se ha llevado a cabo una purificación y una primera caracterización de la proteína Fur de S. aureus, consistente en conocer algunas características básicas de la proteína, así como comprobar que ha mantenido su actividad. Se han elegido estos dos microorganismos ya que ambos son importantes patógenos humanos y pertenecen a grupos distintos, puesto que L. pneumophila se trata de una bacteria Gram negativa, mientras que S. aureus es Gram positiva. Esta primera caracterización tiene como objetivo conseguir toda la información posible que permitirá diseñar una estrategia de búsqueda de potenciales inhibidores mediante cribado de una quimioteca. Por tanto este trabajo se enmarca dentro de un proyecto más amplio de búsqueda de potenciales antimicrobianos basados en la inhibición de la proteína Fur en diferentes microorganismos patógenos

Estudio de las interacciones de FurA y otros reguladores transcripcionales implicados en el metabolismo del hierro y del nitrógeno

Las proteínas Fur (ferric uptake regulator) son una superfamilia de reguladores de la transcripción presentes en la mayoría de los organismos procariotas. Tienen un papel clave en la regulación del metabolismo del hierro y en otros procesos celulares clave, como la defensa frente al estrés oxidativo, la regulación del metabolismo del nitrógeno, la diferenciación de heterocistos en cianobacterias o la virulencia en los patógenos. Se han abordado dos objetivos principales referidos a las proteínas Fur. Por un lado se han estudiado las interacciones entre las proteínas de la familia Fur presentes en Anabaena sp. PCC 7120: FurA, FurB y FurC in vivo. Los resultados obtenidos indican que las proteínas FurA, FurC y en menor medida, FurB, forman homodímeros, y que es muy posible que las tres proteínas interaccionen entre sí. Por otro lado se ha purificado la proteína Fur de Erwinia amylovora y se ha realizado una caracterización parcial. E. amylovora es la bacteria que causa el fuego bacteriano, una enfermedad de las plantas muy extendida y que ha causado graves problemas fitosanitarios y económicos. La captación de hierro en el hospedador es uno de los principales mecanismos de patogenicidad de esta enfermedad por lo que el estudio de Fur permitirá conocer mejor el mecanismo de infección de E. amylovora y aplicar posibles soluciones para remediar el fuego bacteriano. Se ha purificado Fur de E. amylovora por columna de afinidad a Cu2+, se ha hecho un estudio de oligomerización y se ha detectado zinc estructural en su forma reducida

Estrategias de búsqueda de nuevos antimicrobianos

Las infecciones bacterianas son cada vez más difíciles de tratar puesto que los microbios que las causan presentan resistencia a los antibióticos convencionales. El desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos pasa por la identificación de nuevas dianas antibacterianas. En este contexto, una forma de abordar el problema consiste en la búsqueda de compuestos que actúen sobre funciones genéticas del patógeno que sean esenciales para producir la enfermedad in vivo. Es el caso de los genes necesarios para causar virulencia o los implicados en la viabilidad del mismo. La disminución en la concentración de hierro, micronutriente esencial para la mayoría de los seres vivos por el que compiten hospedador y patógeno durante la infección, es una señal que desencadena la expresión de genes de virulencia en el patógeno. En el control de la expresión de muchos de ellos participan homólogos de la proteína Fur (Ferric uptake regulator). Este regulador transcripcional modula la homeostasis del hierro y es esencial para la virulencia de muchos patógenos, convirtiéndolo en un candidato muy interesante como diana terapéutica para la identificación de antibióticos alternativos a los actuales. Los resultados que se presentan en este proyecto máster se enmarcan dentro de una línea de trabajo del grupo de investigación donde se ha desarrollado, encaminada a valorar la idoneidad de Fur como diana terapéutica frente a microorganismos patógenos. Se basa en la búsqueda de compuestos bioactivos que modifiquen la actividad de Fur de patógenos mediante cribado de librerías de compuestos químicos, análisis de la interacción Fur-DNA en presencia de compuestos seleccionados, in vitro, y confirmación de su eficacia in vivo. En particular, el objetivo del trabajo que se desarrolla a continuación es la selección de moduladores de la actividad de Fur de entre un conjunto de compuestos derivados de ferroceno y estudio de su actividad antimicrobiana. Se han fijado como tareas el clonaje, sobrexpresión, purificación y caracterización bioquímica de las proteínas Fur de Listeria monocytogenes EGD-e y Helicobacter pylori 26695 y la identificación de derivados de ferroceno que modulan la actividad de ambas proteínas en ensayos de retardo de movilidad electroforética (EMSA), así como la evaluación de la acción antimicrobiana de los mismos in vivo

Cysteine mutational studies provide insight into a thiol-based redox switch mechanism of metal and DNA binding in FurA from Anabaena sp. PCC 7120

Aims: The ferric uptake regulator (Fur) is the main transcriptional regulator of genes involved in iron homeostasis in most prokaryotes. FurA from Anabaena sp. PCC 7120 contains five cysteine residues, four of them arranged in two redox-active CXXC motifs. The protein needs not only metal but also reducing conditions to remain fully active in vitro. Through a mutational study of the cysteine residues present in FurA, we have investigated their involvement in metal and DNA binding. Results: Residue C101 that belongs to a conserved CXXC motif plays an essential role in both metal and DNA binding activities in vitro. Substitution of C101 by serine impairs DNA and metal binding abilities of FurA. Isothermal titration calorimetry measurements show that the redox state of C101 is responsible for the protein ability to coordinate the metal corepressor. Moreover, the redox state of C101 varies with the presence or absence of C104 or C133, suggesting that the environments of these cysteines are mutually interdependent. Innovation: We propose that C101 is part of a thiol/disulfide redox switch that determines FurA ability to bind the metal corepressor. Conclusion: This mechanism supports a novel feature of a Fur protein that emerges as a regulator, which connects the response to changes in the intracellular redox state and iron management in cyanobacteria

Combination of SPE and fluorescent detection of AQC-derivatives for the determination at sub-mg/L levels of biogenic amines in dairy products

Biogenic amines (BAs) are compounds generated by decarboxylation of their amino acid precursors. Their intake, even at low concentrations, can lead to several types of health problems in sensitive individuals. As they can be easily formed in fermented dairy products, their quantitative determination is very relevant. In the present paper, a method for the quantitative determination of four biogenic amines in different dairy products has been developed, validated and applied to 37 samples of milk, 23 of yogurt, and 14 of kefir. Amines were selectively extracted using solid phase extraction, subsequently derivatizatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate and further determined by High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection. The method’s sensitivity was highly satisfactory, with limits of detection lower than 0.2 mg/L. Optimal linearity and repeatability were also achieved. BAs were not detected in most of the milk samples, but they were found frequently at high levels in yogurt and kefir samples, reaching values of up to 79 mg/kg total BAs in kefir samples. Levels measured should not be a cause for concern for the population at large, but should be known by BAs-sensitive individuals

Cysteine Mutational Studies Provide Insight into a Thiol-Based Redox Switch Mechanism of Metal and DNA Binding in FurA from Anabaena

Aims: The ferric uptake regulator (Fur) is the main transcriptional regulator of genes involved in iron homeostasis in most prokaryotes. FurA from Anabaena sp. PCC 7120 contains five cysteine residues, four of them arranged in two redox-active CXXC motifs. The protein needs not only metal but also reducing conditions to remain fully active in vitro. Through a mutational study of the cysteine residues present in FurA, we have investigated their involvement in metal and DNA binding. Results: Residue C(101) that belongs to a conserved CXXC motif plays an essential role in both metal and DNA binding activities in vitro. Substitution of C(101) by serine impairs DNA and metal binding abilities of FurA. Isothermal titration calorimetry measurements show that the redox state of C(101) is responsible for the protein ability to coordinate the metal corepressor. Moreover, the redox state of C(101) varies with the presence or absence of C(104) or C(133), suggesting that the environments of these cysteines are mutually interdependent. Innovation: We propose that C(101) is part of a thiol/disulfide redox switch that determines FurA ability to bind the metal corepressor. Conclusion: This mechanism supports a novel feature of a Fur protein that emerges as a regulator, which connects the response to changes in the intracellular redox state and iron management in cyanobacteria. Antioxid. Redox Signal. 24, 173–185