Identificación de mutaciones más frecuentes que confieren resistencia a Rifampicina e Isoniacida en aislados de tuberculosis multidroga resistente en Panamá

Tuberculosis multidroga resistente (TB-MDR) se define como la resistencia de Mycobacterium tuberculosis a los dos principales fármacos del tratamiento antifímico de primera línea, Isoniacida y Rifampicina. TB-MDR representa una amenaza al control global de la TB, ya que para su tratamiento se utilizan fármacos de segunda línea, los cuales son menos efectivos, más caros y más tóxicos. Por lo tanto, un diagnóstico rápido y la prevención de la TB-MDR en la comunidad es indispensable. Actualmente se han logrado grandes avances tecnológicos en el desarrollo de pruebas moleculares rápidas para el diagnóstico oportuno de TB-MI)R debido a que existe una mejor comprensión de los mecanismos genéticos de drogo resistencia en M tuberculosis. Una de las grandes ventajas de utilizar pruebas moleculares en la detección de resistencia es que acorta el tiempo de diagnóstico significativamente, lo que hace posible interrumpir la cadena de transmisión de manera oportuna. Polimorfismos de nucleótido simple es la principal causa de drogo resistencia y a nivel mundial se han descrito las mutaciones más comunes que confieren resistencia a los principales fármacos antifímicos. Aunque la frecuencia de mutaciones genéticas individuales que confieren resistencia ha sido reportada en algunos países de América, no encontramos al momento de la realización de nuestro estudio, publicaciones similares en América Central. El principal objetivo de este estudio es identificar las mutaciones presentes en una colección de aislados TB-MDR recolectados durante los años 2001-2011 en el Departamento de Micobacteriología del Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud. Para ello secuenciamos los aislados TB-MDR y a la vez evaluamos la capacidad de una técnica molecular denominada reacción en cadena de la polimerasa múltiple alelo específico en la detección de resistencia debido a que es una técnica económica y rápida utilizada en países con alta carga de TB-MDR. Los resultados obtenidos en este estudio nos permitirán tener una mejor comprensión de la tuberculosis resistente que circula en nuestro país (dada su posición geográfica como ruta de tránsito) y a la vez servirán como base en la elección de una técnica molecular capaz de detectar la mayor cantidad de mutaciones prevalentes en nuestro país

Identificación de mutaciones más frecuentes que confieren resistencia a Rifampicina e Isoniacida en aislados de tuberculosis multidroga resistente en Panamá

Tuberculosis multidroga resistente (TB-MDR) se define como la resistencia de Mycobacterium tuberculosis a los dos principales fármacos del tratamiento antifímico de primera linea, Isoniacida y Rifampicina TB-MDR representa una amenaza al control global de la TB, ya que para su tratamiento se utilizan fármacos de segunda línea, los cuales son menos efectivos más caros y más tóxicos; Por lo tanto, un diagnóstico rápido y la prevención de la TB-MDR en la comunidad es indispensable. Actualmente se han logrado grandes avances tecnológicos en el desarrollo de pruebas moleculares rápidas para el diagnóstico oportuno de TB-MDR, debido a que existe una mejor comprensión de los mecanismos genéticos de drogo resistencia en M tuberculosis. Una de las grandes ventajas de utilizar pruebas moleculares en la detección de resistencia es que acorta el tiempo de diagnóstico significativamente lo que hace posible interrumpir la cadena de transmisión de manera oportuna. Polimorfismos de nucleótido simple es la principal causa de drogo resistencia y a nivel mundial se han descrito las mutaciones más comunes que confieren resistencia a los principales fármacos antifimicos. Aunque la frecuencia de mutaciones genéticas individuales que confieren resistencia ha sido reportada en algunos países de América, no encontramos al momento de la realización de nuestro estudio publicaciones similares en América Central. El principal objetivo de este estudio es identificar las mutaciones presentes en una colección de aislados TB-MDR recolectados durante los años 2001-2011 en el Departamento de Micobacteriologia del Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud. Para ello secuenciamos los aislados TB-MDR y a la vez evaluamos la capacidad de una técnica molecular denominada reacción en cadena de la polimerasa múltiple alelo especifico en la detección de resistencia debido a que es una técnica económica y rápida utilizada en países con alta carga de TB-MDR. Los resultados obtenidos en este estudio nos permitirán tener una mejor comprensión de la tuberculosis resistente que circula en nuestro país (dada su posición geográfica como ruta de tránsito) y a la vez servirán como base en la elección de una técnica molecular capaz de detectar la mayor cantidad de mutaciones prevalentes en nuestro país

First Evaluation of GenoType MTBDRplus 2.0 Performed Directly on Respiratory Specimens in Central America

The turnaround times for conventional methods used to detect Mycobacterium tuberculosis in sputum samples and to obtain drug susceptibility information are long in many developing countries, including Panama, leading to delays in appropriate treatment initiation and continued transmission in the community. We evaluated the performance of a molecular line probe assay, the Genotype MTBDRplus version 2.0 assay, in detecting M. tuberculosis complex directly in respiratory specimens from smear-positive tuberculosis cases from four different regions in Panama, as well as the most frequent mutations in genes conferring resistance to isoniazid (katG and inhA) and rifampin (rpoB). Our results were confirmed with the nitrate reductase assay and genomic sequencing. M. tuberculosis complex was detected by the Genotype MTBDRplus 2.0 assay with 100% sensitivity and specificity. The sensitivity and specificity for rifampin resistance were 100% and 100%, respectively, and those for isoniazid resistance were 90.7% and 100%. Isoniazid monoresistance was detected in 5.2% of new cases. Genotype MTBDRplus 2.0 is highly accurate in detecting M. tuberculosis complex in respiratory specimens and is able to discriminate isoniazid-monoresistant cases from multidrug-resistant cases within 2 days

Multidrug-Resistant Tuberculosis in Panama Is Driven by Clonal Expansion of a Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strain Related to the KZN Extensively Drug-Resistant M. tuberculosis Strain from South Africa

Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is a significant health problem in Panama. The extent to which such cases are the result of primary or acquired resistance and the strain families involved are unknown. We performed whole-genome sequencing of a collection of 66 clinical MDR isolates, along with 31 drug-susceptible isolates, that were isolated in Panama between 2001 and 2010; 78% of the MDR isolates belong to the Latin American-Mediterranean (LAM) family. Drug resistance mutations correlated well with drug susceptibility profiles. To determine the relationships among these strains and to better understand the acquisition of resistance mutations, a phylogenetic tree was constructed based on a genome-wide single-nucleotide polymorphism analysis. The phylogenetic tree shows that the isolates are highly clustered, with a single strain (LAM9-c1) accounting for nearly one-half of the MDR isolates (29/66 isolates). The LAM9-c1 strain was most prevalent among male patients of working age and was associated with high mortality rates. Members of this cluster all share identical mutations conferring resistance to isoniazid (KatG S315T mutation), rifampin (RpoB S531L mutation), and streptomycin (rrs C517T mutation). This evidence of primary resistance supports a model in which MDR-TB in Panama is driven by clonal expansion and ongoing transmission of several strains in the LAM family, including the highly successful MDR strain LAM9-c1. The phylogenetic analysis also shows that the LAM9-c1 strain is closely related to the KwaZulu-Natal (KZN) extensively drug-resistant TB strain identified in KwaZulu-Natal, South Africa. The LAM9-c1 and KZN strains likely arose from a recent common ancestor that was transmitted between Panama and South Africa and had the capacity to tolerate an accumulation of multiple resistance mutations

Use of Multiplex Allele-Specific Polymerase Chain Reaction (MAS-PCR) to Detect Multidrug-Resistant Tuberculosis in Panama

The frequency of individual genetic mutations conferring drug resistance (DR) to Mycobacterium tuberculosis has not been studied previously in Central America, the place of origin of many immigrants to the United States. The current gold standard for detecting multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is phenotypic drug susceptibility testing (DST), which is resource-intensive and slow, leading to increased MDR-TB transmission in the community. We evaluated multiplex allele-specific polymerase chain reaction (MAS-PCR) as a rapid molecular tool to detect MDR-TB in Panama. Based on DST, 67 MDR-TB and 31 drug-sensitive clinical isolates were identified and cultured from an archived collection. Primers were designed to target five mutation hotspots that confer resistance to the first-line drugs isoniazid and rifampin, and MAS-PCR was performed. Whole-genome sequencing confirmed DR mutations identified by MAS-PCR, and provided frequencies of genetic mutations. DNA sequencing revealed 70.1% of MDR strains to have point mutations at codon 315 of the katG gene, 19.4% within mabA-inhA promoter, and 98.5% at three hotspots within rpoB. MAS-PCR detected each of these mutations, yielding 82.8% sensitivity and 100% specificity for isoniazid resistance, and 98.4% sensitivity and 100% specificity for rifampin resistance relative to DST. The frequency of individual DR mutations among MDR strains in Panama parallels that of other TB-endemic countries. The performance of MAS-PCR suggests that it may be a relatively inexpensive and technically feasible method for rapid detection of MDR-TB in developing countries

Distinct band patterns indicate drug resistance profile of isolates.

<p>A. Loci where each allele-specific primer binds are indicated, along with the expected product size if the locus is wild-type. The two common mutations that confer resistance to INH and the three common mutations that confer resistance to RIF are boxed separately. B. Band patterns indicate drug resistance profile of isolates. Expected PCR products have been color-coded in the same way as in A. Lane 1: H37Rv reference strain (wild-type at all 5 loci); Lane 2: <i>mabA-inhA</i> −15C→T and RpoB D516F double mutant; Lane 3: KatG S315T and RpoB H526Y double mutant; Lane 4: KatG S315G and RpoB 531L double mutant; Lane 5: <i>mabA-inhA</i> −15C→T, KatG S315T and RpoB H526D triple mutant; lane 6: <i>mabA-inhA</i> −15C→T, KatG S315T and RpoB S531L triple mutant; Lane 7: Molecular ladder.</p

Flow-chart showing available drug susceptibility testing (DST), sequencing, and multiplex allele-specific PCR (MAS-PCR) results for the 98 archived isolates from Panama.

<p>Flow-chart showing available drug susceptibility testing (DST), sequencing, and multiplex allele-specific PCR (MAS-PCR) results for the 98 archived isolates from Panama.</p

Pairwise comparisons of the three drug resistance detection techniques (DST, DNA sequencing, and MAS-PCR) in detecting INH and RIF resistance.

<p>Pairwise comparisons of the three drug resistance detection techniques (DST, DNA sequencing, and MAS-PCR) in detecting INH and RIF resistance.</p