Integration between experimental and simulation techiques to elucidate aspects related to acrosomal exocytosis

El espermatozoide posee un gránulo secretorio (acrosoma) que exocita frente a diferentes estímulos, en un proceso denominado exocitosis acrosomal (EA). Se ha demostrado que antes de la EA, el acrosoma se hincha y la membrana acrosomal externa (MAE) sufre invaginaciones/evaginaciones necesarias para que ocurra la aposición de la misma con la membrana plasmática, permitiendo la fusión en múltiples puntos. Postulamos que el aumento de superficie que ocurre en la MAE se debe a remodelación lipídica. Nuestra hipótesis es que los estímulos exocíticos cambian la composición y distribución de lípidos de las membranas permitiendo la fusión de las mismas. El requerimiento espacial de las regiones polares y no polares de los lípidos determina su forma geométrica (cónica, cónica invertida y cilíndrica), afectando la curvatura de las membranas. El objetivo general de esta propuesta es investigar la dinámica de remodelación/relocalización de lípidos de membrana durante la EA, recurriendo al uso combinado de experimentos y modelado computacional. El plan de trabajo se realizara en el Grupo de Biofísica y Materia Condensada Blanda, liderado por el Dr. Del Pópolo en la FCEN, y la parte experimental en el Lab. De Lípidos y Exocitosis Acrosomal, de la Dra. Silvia Belmonte en el IHEM. Como objetivos específicos proponemos: 1-Cuantificar la correlación entre composición de lípidos y curvatura de membrana, usando técnicas de biofísica computacional. Objetivo que se desprende como una continuación del proyecto anterior; 2-Poner a punto la técnica de microscopía electrónica de transmisión para evaluar el efecto de la adición exógena de lípidos con diferente geometría. El análisis biofísico-computacional se realizará mediante la aplicación del modelo grano grueso (GG) MARTINI que proveerá información sobre composición de lípidos y curvatura local. Aplicaremos la Dinámica Molecular basada en modelos de GG para dilucidar los detalles a escala molecular del proceso de fusión, focalizándonos en la redistribución de lípidos. El resultado final del proyecto será un modelo de procesos biofísicos y un modelo experimental que logren explicar lo que ocurre durante la EA.The human spermatozoa has a secretory granule, the acrosome, that exocites its content when challenged with different stimuli in a process named acrosomal exocytosis (AE). Prior to exocytosis, the acrosome swolens and its membrane contacts the plasma membrane allowing fusion in multiple points. We postulate that the increase in surface area of the acrosomal membrane is due to lipid turnover. Our hypothesis is that exocytic stimuli produce changes in lipid composition and distribution facilitating membrane fusion. Also spacial requirements of polar and non-polar regions of lipids dictates its geometrical shape (cone, inverted cone and cylindrical), affecting overall membrane curvature. The primary goal of this proposal is to dilucidate remodeling/relocalization of membrane lipids that occur during AE by using computational modeling. This work will be carried out at Dr. M.G. Del Popolo's group at FCEN and the experimental part will be developed at Dr. S.A. Belmonte's laboratory at IHEM. The specific objectives are: 1-Quantify correlationship between lipid composition and membrane curvature. This will be donde by applying computational biophysics techniques, as a continuance of previous work; 2-set up electron microscopy method to evaluate the effect of exogenous addition of curvature-inducing lipids with different geometry. The biophysical computational analysis will be carried out by applying Martini Coarse Grained (CG) that will provide information regarding lipid composition and local curvature. We will apply Molecular Dynamics based in CG models to dilucidate molecular-scale details of the fusion process focusing in lipid redistribution. We look forward to generate a model that would be able to describe and understand the biophysical processes that occurs during AE

Participación de PKC/ERK en la fosforilación de esfingosina kinasa durante la reacción acrosomal de espermatozoides humanos

El espermatozoide posee una única vesícula secretoria que exocita frente a diferentes estímulos. Este proceso se denomina reacción acrosomal (RA) y es requerido para la penetración de la zona pelúcida del ovocito por el espermatozoide y para la fertilización. Nuestro interés se centró en el efecto ejercido por esfingosina 1-fosfato (S1P) y la enzima que regula su producción, esfingosina quinasa (SK), en la exocitosis regulada. En trabajos previos, determinamos que S1P inducía la RA en espermatozoides humanos activando receptores acoplados a proteína Gi. El lípido provocó un aumento de calcio intracelular en células vivas, activó PLC, PKC y la pequeña GTPasa, Rab3A. Presentamos evidencia de la presencia, localización y requerimiento de SK1 para que ocurra la RA. Los ensayos funcionales demostraron que el diacilglicerol (DAG) (lípido inductor de la RA) necesita la activación de SK1 para inducir exocitosis.Fil: Resa Jurin , Lucas A.. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histologia y Embriología Mendoza. "Dr. Mario H. Burgos"Fil: Suhaiman, Laila. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histologia y Embriología Mendoza. "Dr. Mario H. Burgos"Fil: Belmonte, Silvia A.. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histologia y Embriología Mendoza. "Dr. Mario H. Burgos

Ceramide induces a multicomponent intracellular calcium increase triggering the acrosome secretion in human sperm

Exocytosis of spermatozoon's secretory vesicle, named acrosome reaction (AR), is a regulated event that plays a central role in fertilization. It is coupled to a complex calcium signaling. Ceramide is a multitasking lipid involved in exocytosis. Nevertheless, its effect on secretion is controversial and the underlying cellular and molecular mechanisms remain unknown. Human spermatozoa are useful to dissect the role of ceramide in secretion given that the gamete is not capable to undergo any trafficking mechanisms other than exocytosis. We report for the first time, the presence of sphingolipid metabolism enzymes such as neutral-sphingomyelinase and ceramide synthase in sperm. Ceramidases are also present and active. Both the addition of cell-permeable ceramide and the rise of the endogenous one, increase intracellular calcium acting as potent inducers of exocytosis. Ceramide triggers AR in capacitated spermatozoa and enhances the gamete response to progesterone. The lipid induces physiological ultrastructural changes in the acrosome and triggers an exocytosis-signaling cascade involving protein tyrosine phosphatase 1B and VAMP2. Real-time imaging showed an increment of calcium in the cytosol upon ceramide treatment either in the absence or in the presence of extracellular calcium. Pharmacological experiments demonstrate that at early stages the process involves ryanodine receptors, CatSper (calcium channel of sperm), and store-operated calcium channels. We set out the signaling sequence of events that connect ceramide to internal calcium mobilization and external calcium signals during secretion. These results allow the coordination of lipids and proteins in a pathway that accomplishes secretion. Our findings contribute to the understanding of ceramide's role in regulated exocytosis and fertilization.Fil: Vaquer, Cintia Celina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Suhaiman, Laila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas. - Universidad Nacional de Cuyo. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas; ArgentinaFil: Pavarotti, Martin Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: de Blas, Gerardo Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Belmonte, Silvia Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; Argentin

The pair ceramide 1-phosphate/ceramide kinase regulates intracellular calcium and progesterone-induced human sperm acrosomal exocytosis

Before fertilization, spermatozoa must undergo calcium-regulated acrosome exocytosis in response to physiological stimuli such as progesterone and zona pellucida. Our laboratory has elucidated the signaling cascades accomplished by different sphingolipids during human sperm acrosomal exocytosis. Recently, we established that ceramide increases intracellular calcium by activating various channels and stimulating the acrosome reaction. However, whether ceramide induces exocytosis on its own, activation of the ceramide kinase/ceramide 1-phosphate (CERK/C1P) pathway or both is still an unsolved issue. Here, we demonstrate that C1P addition induces exocytosis in intact, capacitated human sperm. Real-time imaging in single-cell and calcium measurements in sperm population showed that C1P needs extracellular calcium to induce [Ca2+]i increase. The sphingolipid triggered the cation influx through voltage-operated calcium (VOC) and store-operated calcium (SOC) channels. However, it requires calcium efflux from internal stores through inositol 3-phosphate receptors (IP3R) and ryanodine receptors (RyR) to achieve calcium rise and the acrosome reaction. We report the presence of the CERK in human spermatozoa, the enzyme that catalyzes C1P synthesis. Furthermore, CERK exhibited calcium-stimulated enzymatic activity during the acrosome reaction. Exocytosis assays using a CERK inhibitor demonstrated that ceramide induces acrosomal exocytosis, mainly due to C1P synthesis. Strikingly, progesterone required CERK activity to induce intracellular calcium increase and acrosome exocytosis. This is the first report, implicating the bioactive sphingolipid C1P in the physiological progesterone pathway leading to the sperm acrosome reaction

ADP ribosylation factor 6 (ARF6) promotes acrosomal exocytosis by modulating lipid turnover and Rab3A activation.

Regulated secretion is a central issue for the specific function of many cells; for instance, mammalian sperm acrosomal exocytosis is essential for egg fertilization. ARF6 (ADP-ribosylation factor 6) is a small GTPase implicated in exocytosis, but its downstream effectors remain elusive in this process. We combined biochemical, functional, and microscopy-based methods to show that ARF6 is present in human sperm, localizes to the acrosomal region, and is required for calcium and diacylglycerol-induced exocytosis. Results from pulldown assays show that ARF6 exchanges GDP for GTP in sperm challenged with different exocytic stimuli. Myristoylated and guanosine 5'-3-O-(thio)triphosphate (GTPγS)-loaded ARF6 (active form) added to permeabilized sperm induces acrosome exocytosis even in the absence of extracellular calcium. We explore the ARF6 signaling cascade that promotes secretion. We demonstrate that ARF6 stimulates a sperm phospholipase D activity to produce phosphatidic acid and boosts the synthesis of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. We present direct evidence showing that active ARF6 increases phospholipase C activity, causing phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate hydrolysis and inositol 1,4,5-trisphosphate-dependent intra-acrosomal calcium release. We show that active ARF6 increases the exchange of GDP for GTP on Rab3A, a prerequisite for secretion. We propose that exocytic stimuli activate ARF6, which is required for acrosomal calcium efflux and the assembly of the membrane fusion machinery. This report highlights the physiological importance of ARF6 as a key factor for human sperm exocytosis and fertilization.journal articleresearch support, non-u.s. gov't2015 Apr 102015 02 20importe

Birnaviral Hijacking of Endosomal Membranes

Birnaviruses form a distinct class of double-stranded RNA (dsRNA) viruses characterized by the absence of a transcription-competent inner core particle. The early endosomes (EE) of cells infected with the infectious bursal disease virus (IBDV) - a prototypical birnavirus and an important avian pathogen - constitute a platform for viral replication. Here, we study the mechanism of birnaviral hijacking of EE membranes for this process. We demonstrate that the viral protein 3 (VP3) specifically binds to phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P) present in EE membranes. We identify the domain of VP3 involved in PI3P-binding and its role in viral replication. Finally, our molecular simulations results unveil a two-stage modular mechanism for VP3 association with EE. Firstly, the carboxy-terminal region of VP3 adsorbs to the membrane via non-specific electrostatic interactions. Then, in the second stage, the VP3 core seals the membrane engagement by specifically binding PI3P through its P2 domain, additionally promoting PI3P accumulation.Fil: Zanetti, Flavia Adriana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein"; ArgentinaFil: Fernandez, Ignacio. Institut Pasteur de Paris. Departamento de Virología; FranciaFil: Baquero, Eduard. Institut Pasteur de Paris. Departamento de Virología; FranciaFil: Guardado Calvo, Pablo. Institut Pasteur de Paris. Departamento de Virología; FranciaFil: Dubois, Sarah. Université Paris Cité; FranciaFil: Morel, Etienne. Université Paris Cité; FranciaFil: Alfonso, Victoria. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Aguilera, Milton Osmar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Celayes Maldonado, María Emilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Polo Ilacqua, Luis Mariano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Suhaiman, Laila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas. - Universidad Nacional de Cuyo. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas; ArgentinaFil: Galassi, Vanesa Viviana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas. - Universidad Nacional de Cuyo. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas; ArgentinaFil: Chiarpotti, Maria Vanina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas. - Universidad Nacional de Cuyo. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas; ArgentinaFil: Allende, Carolina. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Centro Nacional de Biotecnología; EspañaFil: Rodríguez, Javier M.. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Centro Nacional de Biotecnología; EspañaFil: Castón, José R.. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Centro Nacional de Biotecnología; EspañaFil: Lijavetzky, Diego Claudio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Biología Agrícola de Mendoza. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Biología Agrícola de Mendoza; ArgentinaFil: Taboga, Oscar Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Colombo, Maria Isabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: del Popolo, Mario Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas. - Universidad Nacional de Cuyo. Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas; ArgentinaFil: Rey, Félix Augusto. Institut Pasteur de Paris.; FranciaFil: Delgui, Laura Ruth. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; Argentin

Optimized protocols to analyze sphingosine 1-phosphate signal transduction pathways during acrosomal exocytosis in human sperm

Regulated secretion is a central issue for the specific function of many cells; for instance, mammalian sperm acrosomal exocytosis is essential for egg fertilization. Sphingosine 1-phosphate is a bioactive sphingolipid that regulates crucial physiological processes. We recently reported that sphingosine 1-phosphate and sphingosine kinase are involved in a novel signaling pathway leading to acrosomal exocytosis. Acrosomal exocytosis in mammalian sperm is a regulated secretion with unusual characteristics. We therefore employed biochemical functional assays to assess the sphingolipid signaling in both permeabilized and non-permeabilized sperm. The exocytosis of the acrosomal content is regulated by Ca2+. During exocytosis changes in [Ca2+]i occur induced by either Ca2+-influx or Ca2+-mobilization from intracellular stores. By using single cell [Ca2+] measurements we detected intracellular Ca2+ changes after sphingosine 1-phosphate treatment. Additionally, measuring sphingosine kinase activity we determined that sphingosine 1-phosphate levels increase after an exocytotic stimulus. This chapter is designed to provide the user with sufficient background to analyze sphingosine 1-phosphate signal transduction pathways during acrosomal exocytosis in human sperm.Fil: Belmonte, Silvia Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto Histología y Embriología D/mend Dr.m.burgos; ArgentinaFil: Suhaiman, Laila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto Histología y Embriología D/mend Dr.m.burgos; Argentin

Diacylglycerol stimulates acrosomal exocytosis by feeding into a PKC- and PLD1-dependent positive loop that continuously supplies phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate

Acrosomal exocytosis involves a massive fusion between the outer acrosomal and the plasma membranes of the spermatozoon triggered by stimuli that open calcium channels at the plasma membrane. Diacylglycerol has been implicated in the activation of these calcium channels. Here we report that this lipid promotes the efflux of intraacrosomal calcium and triggers exocytosis in permeabilized human sperm, implying that diacylglycerol activates events downstream of the opening of plasma membrane channels. Furthermore, we show that calcium and diacylglycerol converge in a signaling pathway leading to the production of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Addition of diacylglycerol promotes the PKC-dependent activation of PLD1. Rescue experiments adding phosphatidic acid or PIP2 and direct measurement of lipid production suggest that both PKC and PLD1 promote PIP2 synthesis. Inhibition of different steps of the pathway was reverted by adenophostin, an agonist of IP3-sensitive calcium channels, indicating that PIP2 is necessary to keep these channels opened. However, phosphatidic acid, PIP2, or adenophostin could not trigger exocytosis by themselves, indicating that diacylglycerol must also activate another factor. We found that diacylglycerol and phorbol ester stimulate the accumulation of the GTP-bound form of Rab3A. Together our results indicate that diacylglycerol promotes acrosomal exocytosis by i) maintaining high levels of IP3 – an effect that depends on a positive feedback loop leading to the production of PIP2 – and ii) stimulating the activation of Rab3A, which in turn initiates a cascade of protein interactions leading to the assembly of SNARE complexes and membrane fusion.Fil: Lopez, Cecilia Ines. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza; ArgentinaFil: Pelletán, Leonardo Enuar. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza; ArgentinaFil: Suhaiman, Laila. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza; ArgentinaFil: de Blas, Gerardo Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Vitale, Nicolas. Université de Strasbourg; Francia. Centre National de la Recherche Scientifique; FranciaFil: Mayorga, Luis Segundo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Belmonte, Silvia Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; Argentin

The pair ceramide 1-phosphate/ceramide kinase regulates intracellular calcium and progesterone-induced human sperm acrosomal exocytosis

Before fertilization, spermatozoa must undergo calcium-regulated acrosome exocytosis in response to physiological stimuli such as progesterone and zona pellucida. Our laboratory has elucidated the signaling cascades accomplished by different sphingolipids during human sperm acrosomal exocytosis. Recently, we established that ceramide increases intracellular calcium by activating various channels and stimulating the acrosome reaction. However, whether ceramide induces exocytosis on its own, activation of the ceramide kinase/ceramide 1-phosphate (CERK/C1P) pathway or both is still an unsolved issue. Here, we demonstrate that C1P addition induces exocytosis in intact, capacitated human sperm. Real-time imaging in single-cell and calcium measurements in sperm population showed that C1P needs extracellular calcium to induce [Ca2+]i increase. The sphingolipid triggered the cation influx through voltage-operated calcium (VOC) and store-operated calcium (SOC) channels. However, it requires calcium efflux from internal stores through inositol 3-phosphate receptors (IP3R) and ryanodine receptors (RyR) to achieve calcium rise and the acrosome reaction. We report the presence of the CERK in human spermatozoa, the enzyme that catalyzes C1P synthesis. Furthermore, CERK exhibited calcium-stimulated enzymatic activity during the acrosome reaction. Exocytosis assays using a CERK inhibitor demonstrated that ceramide induces acrosomal exocytosis, mainly due to C1P synthesis. Strikingly, progesterone required CERK activity to induce intracellular calcium increase and acrosome exocytosis. This is the first report, implicating the bioactive sphingolipid C1P in the physiological progesterone pathway leading to the sperm acrosome reaction.Fil: Vaquer, Cintia Celina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Suhaiman, Laila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; Argentina. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas; ArgentinaFil: Pavarotti, Martin Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Arias, Rodolfo José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; Argentina. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas; ArgentinaFil: Pacheco Guiñazú, Anahi Belén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: de Blas, Gerardo Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; Argentina. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas; ArgentinaFil: Belmonte, Silvia Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; Argentina. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Médicas; Argentin

Video3_The pair ceramide 1-phosphate/ceramide kinase regulates intracellular calcium and progesterone-induced human sperm acrosomal exocytosis.AVI

Before fertilization, spermatozoa must undergo calcium-regulated acrosome exocytosis in response to physiological stimuli such as progesterone and zona pellucida. Our laboratory has elucidated the signaling cascades accomplished by different sphingolipids during human sperm acrosomal exocytosis. Recently, we established that ceramide increases intracellular calcium by activating various channels and stimulating the acrosome reaction. However, whether ceramide induces exocytosis on its own, activation of the ceramide kinase/ceramide 1-phosphate (CERK/C1P) pathway or both is still an unsolved issue. Here, we demonstrate that C1P addition induces exocytosis in intact, capacitated human sperm. Real-time imaging in single-cell and calcium measurements in sperm population showed that C1P needs extracellular calcium to induce [Ca2+]i increase. The sphingolipid triggered the cation influx through voltage-operated calcium (VOC) and store-operated calcium (SOC) channels. However, it requires calcium efflux from internal stores through inositol 3-phosphate receptors (IP3R) and ryanodine receptors (RyR) to achieve calcium rise and the acrosome reaction. We report the presence of the CERK in human spermatozoa, the enzyme that catalyzes C1P synthesis. Furthermore, CERK exhibited calcium-stimulated enzymatic activity during the acrosome reaction. Exocytosis assays using a CERK inhibitor demonstrated that ceramide induces acrosomal exocytosis, mainly due to C1P synthesis. Strikingly, progesterone required CERK activity to induce intracellular calcium increase and acrosome exocytosis. This is the first report, implicating the bioactive sphingolipid C1P in the physiological progesterone pathway leading to the sperm acrosome reaction.</p