Surveillance studies of Lymphocystis disease virus in farmed gilthead seabream (Sparus aurata) by real-time PCR

Lymphocystis disease (LCD) is the main viral infection reported to affect cultured gilthead seabream (Sparus aurata) in Southern Atlantic and Mediterranean aquaculture. Its etiological agent is the Lymphocystis disease virus (LCDV), a member of the family Iridoviridae (genus Lymphocystivirus). The only adequate measures for LCD prevention in the aquaculture systems are general prophylactic practices, such as the control of fish to be introduced in the farm facilities in order to detect carrier fish. These animals may pose a risk for the introduction of LCDV in fish farms, as direct contact between fish specimens is considered the main route of LCDV spreading. More recently, asymptomatic carrier breeders, as well as virus contaminated-live food, have been involved in LCDV transmission to fish larvae. The detection of subclinical viral infections in carrier fish requires the use of sensitive diagnostic methods. In this context, the objective of this study was to establish the applicability of a real-time PCR assay for LCDV diagnosis in surveillance studies. In addition, the assay has been evaluated with samples from a gilthead seabream hatchery, in order to prove its utility to trace the origin of LCDV in fish farms. Juvenile fish were collected at four farms with different background regarding to LCD. LCDV was detected in all farms, and 30 to 100% of fish were identified as LCDV-infected. Estimated viral load in caudal fin of asymptomatic fish was two to five orders of magnitude lower than in diseased fish. Carrier fish were also identified in the broodstock from a farm with LCD records by analysing caudal fin samples by qPCR. In this farm, the q-PCR assay developed in this study allowed the quantitative detection of LCDV in all samples collected in the hatchery, including fertilized eggs, larvae and fingerlings, and also rotifer cultures and artemia metanauplii and cysts used for larval rearing.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Desarrollo de una vacuna DNA para el control de la enfermedad de linfocistis

Leiva, R., Borrego, J.J., Castro, D. y Labella, A.M. 2018. Desarrollo de una vacuna DNA para el control de la enfermedad de linfocistis. En: La Acuicultura en el Litoral Suratlántico. IX Jornadas de Acuicultura en el Litroral Suratlántico, p 96. Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA), Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural, Junta de Andalucía.El virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV) es el agente etiológico de la enfermedad de linfocistis, que afecta tanto a peces marinos como dulceacuícolas. Esta enfermedad supone un grave problema para el sector de la acuicultura, provocando pérdidas económicas debido a su alta morbilidad. En el presente estudio se ha desarrollado un plásmido recombinante con objeto de ser utilizado como vacuna de DNA para limitar la incidencia de dicha enfermedad en el cultivo de dorada (Sparus aurata). El gen codificante de la proteína principal de la cápside (MCP) del LCDV de dorada (LCDV-Sa) se clonó en primer lugar en el vector de expresión pGEX-6P-3, con el fin de expresar la MCP viral como proteína de fusión con GST (glutathione S-transferase) en Escherichia coli BL-21. La expresión de la proteína de fusión MCP-GST en células bacterianas se comprobó mediante Western blot e inmunoensayo dot-blot con anticuerpos específicos dirigidos contra la MCP y la GST. Esta MCP recombinante se empleará como antígeno de captura para la detección mediante ELISA de anticuerpos anti-LCDV en peces vacunados. Por otra parte, el gen codificante de la MCP se subclonó en el vector de expresión pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO, obteniéndose así el plásmido vacunal. Tras su amplificación en E. coli TOP 10, el plásmido se purificó y se utilizó para transfectar la línea celular de dorada SAF-1, evaluándose dos métodos de transfección: Nucleofector Kit y lipofectamina. La expresión de la MCP viral en células SAF-1 transfectadas con el plásmido vacunal se ha demostrado mediante detección de la GFP (green fluorescent protein) por microscopía de epifluorescencia, y por inmunodetección de la MCP viral utilizando anticuerpos específicos. El plásmido vacunal obtenido se inyectará intramuscularmente en ejemplares de dorada para determinar la distribución y expresión temporal de la vacuna, así como para detectar anticuerpos anti-LCDV en los peces vacunados.Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía (P12-RNM-2261). Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Persistencia del virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV) en agua

El virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV), perteneciente al género Lymphocystivirus (familia Iridoviridae), es el agente etiológico de la enfermedad de linfocistis (LCD), principal patología de origen vírico descrita en doradas en la acuicultura marina mediterránea. Aunque esta enfermedad es muy frecuente, las vías de transmisión de su agente etiológico no se han dilucidado completamente, considerándose el contacto directo entre peces o la ruta hídrica las principales vías de entrada del virus en los sistemas acuícolas. Aunque el LCDV puede transmitirse vía hídrica, al menos de forma experimental, no existen resultados sobre su persistencia en agua de mar, lo que es esencial para determinar la importancia del agua como ruta de transmisión del virus en las piscifactorías marinas. En el presente trabajo se ha abordado el estudio de la capacidad de persistencia del LCDV en agua de mar sometida a diferentes tratamientos, observándose el efecto de los factores bióticos y abióticos sobre dicha persistencia. Para el estudio se utilizó un stock vírico de la cepa de colección ATCC VR-342, usando agua de mar artificial y agua de mar sometida a tratamientos (esterilización por calor húmedo y filtración) para eliminar microorganismos y materia orgánica presentes en el agua, evaluándose el efecto de estos tratamientos, así como la temperatura (18°C y 22°C) y la carga viral, en la infectividad del virus. Se determinó el título infectivo de las suspensiones víricas en las muestras a diferentes tiempos mediante ensayo en cultivos celulares, aplicando el método de dilución final de efecto citopático (TCID50) y ensayo ICC-RT-PCR (Integrated Cell Culture-RT-PCR). Los resultados obtenidos indican que los factores abióticos presentes en el agua sometida a esterilización por filtración y calor no afectan significativamente a la persistencia del virus. Sin embargo, se ha demostrado que tanto la temperatura como la carga vírica son factores determinantes de la persistencia del LCDV en agua.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Revisiting the genus Photobacterium: taxonomy, ecology and pathogenesis

The genus Photobacterium, one of the eight genera included in the family Vibrionaceae, contains 27 species with valid names and it has received attention because of the bioluminescence and pathogenesis mechanisms that some of its species exhibit. However, the taxonomy and phylogeny of this genus are not completely elucidated; for example, P. logei and P. fischeri are now considered members of the genus Aliivibrio, and previously were included in the genus Vibrio. In addition, P. damselae subsp. piscicida was formed as a new combination for former Vibrio damsela and Pasteurella piscicida. Moreover, P. damselae subsp. damselae is an earlier heterotypic synonym of P. histaminum. To avoid these incovenences draft and complete genomic sequences of members of Photobacterium are increasingly becoming available and their use is now routine for many research laboratories to address diverse goals: species delineation with overall genomic indexes, phylogenetic analyses, comparative genomics, and phenotypic inference. The habitats and isolation source of the Photobacterium species include seawater, sea sediments, saline lake waters, and a variety of marine organisms with which the photobacteria establish different relationships, from symbiosis to pathogenic interactions. Several species of this genus contain bioluminescent strains in symbiosis with marine fish and cephalopods; in addition, other species enhance its growth at pressures above 1 atmosphere, by means of several high-pressure adaptation mechanisms and for this, they may be considered as piezophilic (former barophilic) bacteria. Until now, only P. jeanii, P. rosenbergii, P. sanctipauli, and the two subspecies of P. damselae have been reported as responsible agents of several pathologies on animal hosts, such as corals, sponges, fish and homeothermic animals. In this review we have revised and updated the taxonomy, ecology and pathogenicity of several members of this genus. [Int Microbiol 20(1): 1-10 (2017)]Keywords: Photobacterium · taxonomy · symbiosis · pathogenesis · virulence factor

Desarrollo y evaluación de una vacuna DNA contra el virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV)

El virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV) infecta tanto a peces marinos como dulceacuícolas, produciendo una patología que supone un grave problema para la acuicultura debido a las pérdidas económicas asociadas a su alta morbilidad. En el presente estudio se ha desarrollado un plásmido recombinante con objeto de ser utilizado como vacuna DNA para limitar la incidencia de dicha enfermedad en el cultivo de dorada (Sparus aurata). Para ello, se clonó el ORF de la proteína principal de la cápside (MCP) del LCDV de dorada (LCDV-Sa) en el plásmido de expresión pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO, y se utilizó para transfectar la línea celular de dorada SAF-1. Los resultados muestran la correcta expresión del plásmido vacunal en estas células mediante la detección de GFP por microscopía de fluorescencia e inmunodetección de la MCP viral. Posteriormente, se realizó un experimento de vacunación por inyección intramuscular (0,15 µg/g pez) en doradas juveniles, estudiándose la distribución y expresión del plásmido vacunal. Los análisis de PCR y RT-PCR realizados muestran que la vacuna se distribuye de forma sistémica, expresándose en los diferentes tejidos analizados. También se evaluó la protección conferida por la vacuna frente a la infección por LCDV inyectado intraperitonealmente (105 TCID50/g pez) a los 21 d post-vacunación, analizándose la presencia de genoma viral a los 10 d post-inoculación en peces vacunados y controles. Sólo se detectó el genoma viral en los grupos controles, demostrándose así que existe una protección frente a la infección por LCDV en los peces vacunados.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Detección y cuantificación del virus de la enfermedad de linfocistis mediante ensayo ICC-RT-PCR (integrated cell culture-RT-PCR)

La enfermedad de linfocistis es la enfermedad de etiología viral más frecuentemente detectada en la acuicultura marina europea, siendo la principal patología de origen vírico descrita en doradas cultivadas. El agente etiológico de esta enfermedad es el virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV), miembro del género Lymphocystivirus, perteneciente a la familia Iridoviridae. Se han desarrollado diversos protocolos de PCR y PCR a tiempo real que permiten la detección y cuantificación del LCDV en diversas muestras, si bien no aportan ninguna indicación de la infectividad de los virus detectados. La detección de partículas víricas infectivas requiere la utilización de cultivos celulares, pero en el caso del LCDV la observación de efectos citopáticos (CPE) es difícil y a menudo está sujeta a subjetividad, especialmente en muestras con baja carga vírica. Por este motivo, en el presente trabajo se ha desarrollado un ensayo de ICC-RT-PCR (Integrated Cell Culture-RT-PCR) que permite la detección de partículas infectivas del LCDV. Este ensayo se ha aplicado en combinación con el método del número más probable (NMP) para la determinación del título infectivo en cultivos celulares. El protocolo de ICC-RT-PCR desarrollado permitió la detección de mRNA viral a partir de células SAF-1 inoculadas con un título infectivo de LCDV de 0,1 TCID50/ml, procesadas a los 5 d p.i, mientras que el límite de detección mediante observación de CPE fue de 10 TCID50/ml a 14 d p.i. La sensibilidad de la técnica he permitido la detección de partículas infectivas del LCDV en ejemplares de dorada asintomáticos, donde no se observaron CPE en cultivos celulares inoculados en paralelo y mantenidos hasta 14 d p.i. Este protocolo también se ha aplicado para la determinación del título infectivo de diferentes aislados víricos obtenidos a partir de peces enfermos, reduciéndose de forma considerable el tiempo necesario para realizar la titulación en comparación con el método de la dosis infectiva 50% en cultivos celulares (TCID50) (5 d versus 14-21 d, respectivamente). Así mismo, se han titulado stocks víricos obtenidos en cultivos celulares, donde la carga vírica es inferior al límite de detección del ensayo de observación de CPE. En conclusión, el protocolo de ICC-RT-PCR desarrollado es una técnica sensible, rápida y útil para la detección y cuantificación de LCDV infectivos, lo que la convierte en una herramienta adecuada para el estudio de esta patología viral.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Desarrollo de un chip de DNA para la detección de dianas génicas bacterianas de interés en el campo de la acuicultura

La adquisición bacteriana de multiresistencias frente a antimicrobianos es un fenómeno cada vez más preocupante, con gran repercusión para la salud pública, pero también con impacto en sectores de la producción animal, como es el caso particular de la acuicultura. Entre los años 2010-2012, como objetivo de un Proyecto de Investigación Italiano (Progetti d’interesse Nazionale, PRIN), se realizaron diferentes campañas de muestreo a lo largo de la costa del mar Adriático, en centros dedicados a la acuicultura y áreas costeras, estudiando la incidencia de bacterias multiresistentes, así como de los elementos genéticos móviles responsables de su adquisición, desarrollando además una herramienta biotecnológica que agiliza este tipo de estudios permitiendo detectar 164 dianas génicas en un único soporte. Se obtuvo una colección de 1274 aislados bacterianos, a partir de muestras de agua, sedimento y biofilm, resistentes a las distintas combinaciones de antibióticos utilizados según la legislación italiana. Del total, 105 (8,25%) aislados resultaron ser multiresistentes, detectándose en el 13,59% el integrón de clase I, en el 14,56% el plásmido pAb5s9, en el 5,82% el elemento SXT/R391, y en el 15,52% diferentes combinaciones de estos elementos genéticos. Basándonos en estos resultados, se ha desarrollado y validado un chip de DNA que permite detectar en un mismo soporte, genes que codifican para determinantes de resistencia a antimicrobianos, elementos genéticos móviles (MGE), genes para la detección de especies bacterianas patógenas con repercusión en acuicultura y para la salud del hombre, e indicadores de contaminación fecal.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Incidencia de los virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV-Sa), papillomavirus (SaPV1) y poliomavirus (SaPyV1) en doradas cultivadas en el área mediterránea

La enfermedad de linfocistis (LCD), causada por el virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV), es una patología común descrita en más de 150 especies de peces en todo el mundo, siendo la enfermedad de etiología viral más frecuentemente detectada en las piscifactorías de dorada (Sparus aurata) localizadas en el sur de Europa. En un estudio previo se secuenció directamente el viroma de lesiones de doradas enfermas, obteniéndose el genoma completo de una nueva especie de LCDV (a la que se ha denominado LCDV-Sa) junto a los genomas completos de dos nuevos virus pertenecientes a los papillomavirus y poliomavirus, denominados Sparus aurata papillomavirus 1 (SaPV1) y Sparus aurata polyomavirus 1 (SaPyV1), respectivamente. En el presente trabajo se han llevado a cabo análisis de PCR y nested-PCR para la detección específica de los 3 virus mencionados en muestras procedentes de 130 especímenes de dorada, tanto asintomáticos como afectados por la LCD, recogidas en diferentes piscifactorías localizadas en España, Italia y Turquía durante los años 2009-2015. Los resultados obtenidos muestran que en los peces enfermos la detección de LCDV-Sa viene casi invariablemente acompañada por la detección de al menos uno de los nuevos virus (98% de las muestras analizadas). Sin embargo, solo un 24% de los peces asintomáticos positivos para LCDV-Sa (74,6% de los animales asintomáticos analizados) resultaron positivos para SaPV1 y/o SaPyV1. Estos resultados confirman la asociación de los tres virus durante el desarrollo de la enfermedad de linfocistis en dorada, si bien se requerirán estudios posteriores para establecer el papel de cada uno de ellos en la patogénesis de dicha enfermedad.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Novel polyomavirus and papillomavirus detected in gilthead seabream infected by lymphocystis disease virus

Lymphocystis disease virus (LCDV), a member of the genus Lymphocystivirus, family Iridoviridae, is the etiological agent of the lymphocystis disease (LCD), a common pathology that has been described in more than 150 different fish species worldwide. Direct sequencing of the virome of lymphocystis lesions from affected gilthead seabream (Sparus aurata) was used to obtain the complete genome sequence of a new LCDV species, named LCDV-Sa, that is the largest vertebrate iridovirus sequenced to date. This approach allowed us to assemble the full-length circular genomes of two previously unknown viruses, tentatively identified as members of the Polyomaviridae and Papillomaviridae families, and named Sparus aurata polyomavirus 1 (SaPyV1) and Sparus aurata papillomavirus 1 (SaPV1), respectively. SaPyV1 genome is a circular 7,299-bp-long DNA with a 52.1% GC content, and contains five nonoverlapping ORFs carried on opposite DNA strands in an organization reminiscent to that found in polyomaviruses. Phylogenetic analyses based on the amino acid sequence of the large T antigen and the VP1 proteins revealed that SaPyV1 clustered with the other currently available polyomavirus-like full-length genomes obtained from fish. SaPV1 genome corresponds to a circular 5,748-bp-long DNA and has a GC content of 39.5%. Although this genome is smaller than that of previously described papillomaviruses (about 8 kbp), it presents a typical papillomavirus organization, with seven ORFs carried on the same strand. Similarity searches identified distant orthologues of the early E1 and E2 proteins involved in replication and transcription, and late structural proteins L1 and L2. Furthermore, one of the others ORFs encodes a small protein (52 amino acids) that contains both a pRB binding domain (LXCXE) and a C-terminal PDZ class 2 binding motif, with are elements typically present in the longer E7 and E6 proteins found in most known papillomaviruses. The conserved genomic organization, the similarity of the main proteins, and the phylogenetical analysis, based on the amino acid sequence of the L1 protein, support that SaPV1 is the first member of the Papillomaviridae family described in fish. Epizootic surveys carried out in gilthead seabream farms in the Mediterranean area showed that LCD is frequently associated with the concurrent appearance of one or both of the new viruses, 98.3% of diseased fish being positive for SaPyV1 and/or SaPV1. In LCDV-infected asymptomatic fish, SaPyV1 and/or SaPV1 were detected in 32.1% of the animals analysed.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Immune response of gilthead seabream (Sparus aurata) after experimental infection with lymphocystis disease virus (LCDV-Sa)

Lymphocystis disease (LCD) is caused by the lymphocystis disease virus (LCDV) (family Iridoviridae), affecting more than 150 fish species from both marine and freshwater environments. A few studies have been focused on the immune defensive mechanisms of fish against LCDV, but only one was conducted during a natural LCD outbreak in gilthead seabream, which is one of the most important cultured fish species in the Mediterranean and the European Atlantic coasts. The aim of this study was the analysis of 23 genes related to the immune response in gilthead seabream specimens after experimental infection with LCDV-Sa using real-time PCR (qRT-PCR) in samples of head kidney and intestine at 1, 3, and 8 dpi. To study the progression of LCDV-Sa infection in gilthead seabreams, the number of viral DNA copies and the expression of mcp were determined in samples of caudal fin, head kidney and intestine. LCDV-Sa was detected by qPCR in all the samples from inoculated fish analysed, whereas no amplification was obtained in samples from the control group. Regarding the gene expression following LCDV-Sa infection, a total of 22 of the 23 genes studied were differentially expressed in head kidney or intestine samples at some time points analysed. Different gene expression profiles were obtained between the organs studied, detecting 18 differentially expressed genes (DEGs) in head kidney samples, four of them exclusively up- or down-regulated (nccrp1, il10, mhcII, and tnfα genes), and 5 genes with a significant change in the expression tendency from 1 to 8 dpi (irf3, isg15, il10, ck10, and c3). In the intestine, 18 DEGs were also detected (14 shared with head kidney), being mx1, casp1, ck3 and tlr9 genes exclusively detected in these samples, and mx1, mx3, irf9 and ighm differentially regulated over time. The results obtained allow us to understand which genes are essential for host-pathogen interactions and could be used as molecular markers for vaccine efficacy evaluation.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech Proyecto de Excelencia Junta de Andalucía Ref. P12-RNM-226