NITRIC OXIDE – BIOCHEMICAL MARKER OF TUBERCULOSIS PATHOGENESIS

Role of nitric oxide in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis has been studied in 77 patients with new infiltrate pulmonary tuberculosis and 34 patients with fibrous cavernous pulmonary tuberculosis. The level of cumulative and endogenous nitrite depended on the clinical form of tuberculosis: in infiltrate pulmonary tuberculosis patients it was within the limits of reference ranges, and in fibrous cavernous pulmonary tuberculosis patients it was significantly lower. Results of statistical analysis point out at the significant homogeneity (monofunctionality) of the set of rates, defining the level of NO metabolites in blood serum in infiltrate pulmonary tuberculosis, namely: impact of adenosine deaminase, levels of α1-protease inhibitor, ceruleoplasmin and age. On the contrary in case of fibrous cavernous pulmonary tuberculosis the diverse (multi-functional) complexes were detected including clinical blood rates providing influence on the reduction of NO level in blood. Nitric oxide in the patients with both clinical forms of tuberculosis correlated with classical markers of system inflammatory response, thus nitric oxide can be regarded as an integral component of inflammatory response with potential evaluation of prognosis of specific lesions during follow-up of changes

Adenosine-regulated mechanisms in the pathogenesis of ventilation disorders in patients with pulmonary tuberculosis

Uncovering involvement of the purinergic system in the pathogenesis of ventilation disorders (VD) may provide additional information about the pathophysiological mechanisms leading to the development of VD in pulmonary tuberculosis (PT). The aim was to identify a relationship between the parameters of adenosine metabolism, inflammatory response and altered ventilation metabolism in PT patients. Materials and methods. Obstructive and mixed PT patients were assigned to subgroups with/without VD for assessing adenosine deaminase activity (ADA-1, 2) in serum, mononuclear cells, neutrophils; ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT); CD26 (dipeptidyl peptidase-4, DPP-4), phagocyte oxidative burst measured by NO generation. Results. PT patients showed decreased ADA-1 and CD26 (DPP-4), but increased ADA-2. Elevated intracellular adenosine concentration was found in mononuclear cells in patients lacking VD, whereas patients with mixed and obstructive VD — had it in neutrophils. Mononuclear cells of patients with PT lacking VD as well as with obstructive VD type had decreased NO3– concentration. Neutrophil hyperactivity was recorded in all groups of PT patients. Patients with PT lacking VD as well as with mixed VD type showed that the parameters of external respiration were associated with activity of extra-/intracellular ADA, whereas obstructive VD was caused by excessive formation of serum adenosine. Changes in respiratory function in PT were associated with decreased level of serum NO radicals, impaired nitrogen-dependent bactericidal phagocyte activity, and overproduced neutrophil oxygen radicals. Conclusion. Purinergic regulation is involved in regulating inflammatory and compensatory processes in PT patients as well as impaired ventilation efficiency. The most severe respiratory disorders observed in PT patients with mixed VD type are associated with the most prominent changes in nucleotidase activity, particularly ecto-ADA-2 and DPP-4/CD26

Матриксные металлопротеиназы в патогенезе вентиляционных нарушений респираторной системы у больных с хроническими формами туберкулеза легких

The imbalance in matrix metalloproteinase (MMP)/inhibitors system leads to degradation of extracellular matrix of connective tissue and pathological remodeling forming the morphological basis for respiratory dysfunction.The objective: to study the relationship between parameters of MMP/inhibitors system in blood and parameters of ventilation and gas exchange disorders in patients with chronic pulmonary tuberculosis (PTB).Subjects and Methods. Patients with the verified diagnosis of tuberculoma (n = 45) and fibrous-cavernous pulmonary tuberculosis (n = 85) were examined. All patients underwent computed tomography of the chest and assessment of respiratory function. Serum concentrations of MMP-1, -3, -8, -9 and their inhibitors TIMP-1 and α2-macroglobulin (MG) were tested by ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Statistica 7.0 and an ANCOVA model were used for statistical analysis which considered the diagnosis and smoking status as factors, and the respiratory function parameters were considered as covariates.Results. In pulmonary tuberculosis patients, the concentrations of MMP-9 and MMP-8 in the blood correlated with extension of lung parenchyma lesions when compared to tuberculomas and fibro-cavernous tuberculosis, MMP-9 and TIMP-1 with changes in lung volumes (R2 = 0.60 and 0.80; p = 0.001), and MMP-8 correlated with functional disorders of gas exchange (R2 = 0.60 and 0.80; p = 0.001). Changes in MMP-1, MMP-3, and α2-MG (R2 = 0.60 and 0.80; p = 0.45) did not correlate with extension of lung parenchymal lesions and decreased lung function.Дисбаланс в системе матриксные металлопротеиназы (ММП) / ингибиторы приводит к деградации внеклеточного матрикса соединительной ткани и патологическому ремоделированию, формируя морфологическую основу для нарушений функции внешнего дыхания (ФВД).Цель исследования: изучить взаимосвязь показателей системы ММП/ингибиторы в крови с показателями вентиляционно-газообменных нарушений у пациентов с хронически текущим туберкулезом легких (ТЛ).Материалы и методы. Обследованы больные с верифицированным диагнозом «туберкулема» (n = 45) и «фиброзно-кавернозный ТЛ» (n = 85). Всем пациентам проведены компьютерная томография органов грудной клетки, оценка ФВД. В сыворотке крови определяли концентрации ММП-1, -3, -8, -9 и их ингибиторов ТИМП-1 и α2-макроглобулина (МГ) методом ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Для статистического анализа применяли Statistica 7.0 и модель ковариационного анализа, в которой в качестве факторов рассматривались диагноз и статус курения, а в качестве ковариат ‒ показатели ФВД.Результаты. У больных ТЛ концентрации ММП-9 и ММП-8 в крови коррелируют с объемом поражения легочной паренхимы при сравнении туберкулем и фибронзо-кавернозного туберкулеза, ММП-9 и ТИМП-1 ‒ с изменениями легочных объемов (R2 = 0,60 и 0,80; p = 0,001), ММП-8 ‒ с функциональными нарушениями газообмена (R2 = 0,60 и 0,80; p = 0,001). Изменения ММП-1, ММП-3 и α2-МГ (R2 = 0,60 и 0,80; p = 0,45) не коррелируют с объемом поражения легочной паренхимы и со снижением функции легких

БАКТЕРИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ

Bactericidal activity of leukocytes was investigated in 63 patients with new infiltrate pulmonary tuberculosis and 28 patients with fibrous cavernous pulmonary tuberculosis. The diverse oxygen-dependent bactericidal activity of phagocytes is typical of the patients suffering from both clinical forms of tuberculosis: reduction of nitrosative stress rates, which is more frequent in those suffering from fibrous cavernous tuberculosis, and increase of oxidative stress rates, which is more intensive in case of fibrous cavernous tuberculosis. The associated functions were detected among immune-competent cells, involved in the bactericidal function: in case of fibrous cavernous tuberculosis – between oxidative stress rates, and in case of infiltrate pulmonary tuberculosis – between nitrosative stress rates; the synergistic effect of respiratory burst was observed. In case of chronic pulmonary tuberculosis, both types of cells were equally responsible for bactericidal functions, while neutrophils were dominating in new infiltrate pulmonary tuberculosis, without prior treatment, being the cells of the first line of defense. The obtained results allowed concluding that in case of new pulmonary tuberculosis without prior treatment, nitrosative stress played the important role in the killing of tuberculous mycobacteria, while in case of chronic tuberculosis – it was oxidative stress.Бактерицидная активность лейкоцитов изучена у 63 больных впервые выявленным инфильтративным туберкулезом легких (ИТЛ) и 28 ‒ фиброзно-кавернозным туберкулезом легких (ФКТ). Для больных с обеими клиническими формами туберкулеза характерна разнонаправленная кислородзависимая бактерицидная активность фагоцитирующих клеток: снижение показателей нитрозилирующего стресса, в большей степени характерное для больных ФКТ, и рост показателей оксидативного стресса, больше выраженного при ФКТ. Выявлена сопряженность функционирования иммунокомпетентных клеток, участвующих в бактерицидной функции: при ФКТ ‒ между показателями оксидативного стресса, при ИТЛ – нитрозилирующего; отмечен синергический эффект респираторного взрыва. Если при хронической форме туберкулеза легких за бактерицидную функцию одинаково «отвечают» оба типа клеток, то при впервые выявленном нелеченном ИТЛ доминирующая роль отводится нейтрофилам как клеткам первой линии защиты. Полученные результаты дают основание полагать, что при впервые выявленном нелеченном туберкулезе легких важная роль в подавлении микобактерий туберкулеза отводится нитрозилирующему стрессу, а при хронической форме туберкулеза – оксидативному

Липидная стратегия повышения биодоступности нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ

In recent years, various approaches to the prodrug design on the basis of anti-HIV active nucleoside compounds used in the therapy are intensively investigated. In this paper, the principles of modifying this class of drugs by lipid substances allowing obtained conjugates to insert in natural lipid transport and metabolic pathways that can increase nucleoside agents bioavailability are described. Literature data associated with the research of the pronucleotide approach serving the purpose of increasing nucleoside drugs therapeutical efficacy and reducing the side effects on the organism are reviewed. Experimental data obtained by the authors in course of research of synthetic routes and properties of the new lipid-modified anti-HIV nucleosides are also presented.В последние годы широко исследуются различные подходы к конструированию пролекарственных соединений на основе применяемых в терапевтической практике анти-ВИЧ-активных нуклеозидных препаратов. В работе рассмотрены принципы модификации лекарственных средств данного класса с помощью веществ липидной природы, позволяющие образующимся конъюгатам встраиваться в естественные пути транспорта и метаболизма природных липидов, что приводит к повышению биодоступности нуклеозидных агентов. Представлены литературные данные, посвященные исследованиям пронуклеотидного подхода для повышения терапевтической эффективности нуклеозидных препаратов и снижения их побочного действия на организм. Также приводятся результаты собственных экспериментальных исследований путей синтеза и свойств новых липидмодифицированных анти-ВИЧ-нуклеозидов

Содержание эндотелиальной синтазы оксида азота в плазме после физических нагрузок различного характера

The purpose of the study is to evaluate the effect of dynamic and static exercises on eNOS concentrations in the blood plasma of athletes who do cyclic and strength kind of sports, as well as in men, who are not involved in any sports.Materials and methods. Determination of plasma concentrations of eNOS was performed by using enzyme immunoassay. Blood samples were collected from weightlifters and track and field athletes before and after static and dynamic exercises.Results. It has been shown that regular exercises contribute to a significant increase in the background level of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the plasma of athletes. It is necessary to note that eNOS is almost twice higher in the weightlifters than in the track and field athletes. eNOS concentrations significantly decrease in athletes after static exercises , but on the contrary, increase after dynamic exercises. eNOS level rise in untrained individuals occurs after all kinds of exercises, although the influence of dynamic exercises is much more pronounced. Plasma concentrations of eNOS in all groups returned to baseline during the recovery period.These results suggest that the underlying mechanism that regulates the amount of eNOS in the plasma during exercises is associated with vascular factors, first and foremost, with the intensity of regional blood flow and its impact on the endothelium surface. Therefore, this protein cannot be positioned as a representative of a myokine group. Цель. Оценить влияние динамической и статической нагрузки на содержание eNOS в плазме крови у спортсменов, тренирующихся в циклических и силовых видах спорта, а также у мужчин, не занимающихся спортом.Материал и методы. Определение концентрации eNOS в плазме крови производилось методом иммуноферментного анализа. Кровь забиралась до и после статической и динамической нагрузки у спортсменов-тяжелоатлетов и спортсменов-легкоатлетов.Результаты. Показано, что регулярные тренировки способствуют значительному возрастанию фонового уровня эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) в плазме спортсменов, причем у тяжелоатлетов он почти вдвое выше, чем у легкоатлетов. После нагрузки статического характера у спортсменов концентрация eNOS существенно снижается, а после нагрузки динамического характера – напротив, возрастает. У нетренированных лиц картина иная – возрастание концентрации eNOS происходит после всех видов нагрузки, хотя влияние динамических упражнений выражено гораздо сильнее. Через 30 мин после нагрузки во всех группах наблюдалась тенденция восстановления содержания eNOS к первоначальному уровню.Заключение. Полученные результаты позволяют предполагать, что основной механизм, регулирующий концентрацию eNOS в плазме крови при физических нагрузках, связан с сосудистыми факторами, прежде всего – с интенсивностью регионарного кровотока и его воздействием на поверхность эндотелия. Представленные данные свидетельствуют в пользу предположения, что данный белок не может являться представителем группы миокинов.

Методы детекции специфических для опухолевой ткани однонуклеотидных соматических мутаций в препаратах цДНК из плазмы крови

Introduction. Liquid biopsy is considered as a minimally invasive method of molecular genetic analysis that can be used for early diagnosis, prognosis of disease development, monitoring of residual disease or treatment outcomes, and selection of optimal drug therapy schemes for a patient. Along with the development of tests based on the study of panels of oncologically significant genes or their regions, for various forms of genetically heterogeneous tumors a promising approach could be the use as an object of liquid biopsy of an individual spectrum of somatic mutations of a particular patient that can be detected on the basis of high-throughput sequencing of tumor tissue.Aim. To determine the applicability of different methods for detecting single-nucleotide somatic mutations detected in tumor tissue of a particular patient in cDNA preparations from blood plasma obtained before surgical removal of the tumor and to evaluate the possibility of quantifying the proportion of the alternative variant in the total pool of cDNA. Materials and methods. We used normal and tumor tissue, as well as blood plasma samples from patients with hepatocellular carcinoma, and various methods for detecting single-nucleotide somatic mutations: real-time polymerase chain reaction (PCR) with intercalating dye or with TaqMan probes, droplet digital PCR and high-throughput sequencing of target amplicons.Results. Using the example of a somatic mutation in the TLN1 gene detected in tumor tissue of a patient with hepatocellular carcinoma, methods were developed and tested, each of which allows specific detection of the mutant variant in small amounts (2 ng) of cDNA from the blood plasma of the same patient. The use of droplet PCR and target amplicon sequencing methods allowed us to quantify the proportion of the mutant variant in the total cDNA pool, which was 19.7 and 23.5 %, respectively.Conclusion. Among the methods investigated, droplet digital PCR and targeted amplicon sequencing allow not only reliable detection of mutant variants in small amounts of cDNA, but also adequate quantification, which is particularly important for the development of ways to monitor tumor growth during treatment. The close values of the proportion of mutant variants in cDNA detected by these methods indicate the accuracy of quantitative analysis and the possibility of their use for cross-validation of the results obtained.Введение. Жидкостная биопсия рассматривается как малоинвазивный способ проведения молекулярно-генетического анализа, который может быть использован для ранней диагностики, прогноза течения заболевания, мониторинга остаточной болезни или результатов лечения, а также выбора оптимальных для пациента схем лекарственной терапии. Наряду с разработкой тестов, основанных на исследовании панелей онкологически значимых генов или их участков, для различных форм генетически гетерогенных опухолей перспективным подходом может стать использование в качестве объекта жидкостной биопсии индивидуального спектра соматических мутаций конкретного больного, которые могут быть выявлены с помощью высокопроизводительного секвенирования опухолевой ткани.Цель исследования - определить возможность использования различных методов детекции однонуклеотидных соматических мутаций, выявленных в опухолевой ткани конкретного пациента, в препаратах циркулирующей ДНК (цДНК) из плазмы крови, полученных до хирургического удаления опухоли, и выявить возможность количественной оценки доли альтернативного варианта в общем пуле цДНК.Материалы и методы. В работе использованы препараты нормальной и опухолевой тканей, плазмы крови пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, а также различные методы детекции однонуклеотидных соматических мутаций: полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени с интеркалирующим красителем или с зондами TaqMan, капельная цифровая ПЦР и высокопроизводительное секвенирование таргетных ампликонов.Результаты. На примере соматической мутации в гене TLN1, выявленной в опухолевой ткани пациента с гепатоцеллюлярной карциномой, разработаны и апробированы методы, каждый из которых позволяет специфично детектировать мутантный вариант в малых количествах (2 нг) цДНК из плазмы крови того же пациента. использование капельной ПЦР и секвенирования таргетных ампликонов позволило провести количественную оценку долей мутантного варианта в общем пуле цДНК, которые составили 19,7 и 23,5 % соответственно.Заключение. Капельная цифровая ПЦР и таргетное секвенирование ампликонов позволяют не только надежно детектировать мутантные варианты в малых количествах цДНК, но и адекватно проводить их количественную оценку, что особенно важно для разработки способов мониторинга опухолевого роста в процессе лечения. Близкие значения доли мутантного варианта в цДНК, детектированной этими методами, свидетельствуют о точности количественного анализа и возможности их использования для кросс-валидации получаемых результатов

Идентификация нового сайта метилирования в промоторном районе гена Sept9 для диагностики гепатоцеллюлярной карциномы

Background. Over 600,000 people die from hepatocellular carcinoma (HCC) each year worldwide. The disease is often detected at advanced stages and in many cases is not curable. Early diagnostic and monitoring of HCC recurrences remains a substantial problem in clinical oncology. That determines the need for a search for highly sensitive and specific biomarkers for the non-invasive of HCC diagnostics. The objective of the study. Identification of the hypermethylated locus in the promoter region of the septin 9 (Sept9) gene based on the annotated methylomes from the public databases. Experimental validation of methylation on a pilot panel of paired clinical samples of patients with HCC, as well as tissue samples from patients with benign liver tumors and lymphocytes from healthy donors. Materials and methods. To analyze the methyl data, samples of HCC from TCGA, hepatocellular adenoma from GEO (Gene Expression Omnibus) depository, peripheral blood cells and tissues of healthy donors from Methbank were used. Experimental validation of methylation levels of the identified site was carried out on a pilot panel of clinical samples by bisulphite pyrosequencing using PyroMark Q24.Results. Based on the analysis of methylome data, we selected cg20275528 site, which is characterized by high level of methylation in HCC tissues and minimal levels of methylation in non-tumor liver tissue, hepatocellular adenoma and peripheral blood of healthy donors. Experimental testing on a pilot panel of clinical specimens showed that the level of marker site methylation in HCC (42 % median) is significantly higher than in non-tumor liver tissues (3 % median) and benign neoplasms (1.5 % median) and exceeds the threshold value in HCC compared to paired samples of adjacent non-tumor liver tissue in 20 out of 30 studied cases (66.6 %). The general possibility for cg20275528 methylation detection in circulating DNA of plasma in HCC patients was shown.Conclusion. The obtained results indicate that the approach to the detection and experimental verification of diagnostically significant markers developed and tested in this study can be used to identify new differentially methylated sites and to establish new approaches for non-invasive HCC diagnosis.Введение. Ежегодно во всем мире от гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) умирают более 600 тыс. человек. Заболевание часто выявляется на поздних стадиях и во многих случаях является некурабельным. Ранняя диагностика и мониторинг развития рецидивов ГЦК продолжают оставаться существенной проблемой клинической онкологии. Это определяет актуальность поиска высокочувствительных и специфичных биомаркеров для неинвазивной диагностики ГЦК. Цель исследования – идентификация гиперметилированного при ГЦК локуса в промоторном районе гена септин 9 (Sept9) на основании анализа общедоступных данных метиломных исследований; экспериментальная валидация метилирования на пилотной панели парных клинических образцов пациентов с ГЦК, а также образцов ткани пациентов с доброкачественными опухолями печени и лимфоцитов здоровых доноров.Материалы и методы. Для анализа метиломных данных были использованы выборки ГЦК TCGA, гепатоцеллюлярной аденомы из депозитария GEO (Gene Expression Omnibus), а также клеток периферической крови и тканей здоровых доноров Methbank. Экспериментальную валидацию уровней метилирования идентифицированного сайта проводили на пилотной выборке клинических образцов с использованием метода бисульфитного пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24.Результаты. На основании анализа метиломных данных нами был выбран сайт cg20275528, который характеризуется высоким уровнем метилирования в тканях ГЦК и минимальными уровнями метилирования в клетках неопухолевой ткани печени, гепатоцеллюлярной аденомы и периферической крови здоровых доноров. Экспериментальная проверка на пилотной выборке клинических образцов показала, что уровень метилирования маркерного сайта в ГЦК (медиана 42 %) значительно выше, чем в неопухолевых тканях печени (медиана 3 %) и доброкачественных новообразованиях (медиана 1,5 %) и превышает пороговое значение в ГЦК по сравнению с парными образцами прилежащей неопухолевой ткани печени в 20 (66,6 %) из 30 исследованных случаев. Показана принципиальная возможность детекции метилирования cg20275528 в циркулирующей ДНК плазмы больных ГЦК.Заключение. Полученные результаты позволяют предположить, что разработанный и апробированный в этой работе подход к поиску и экспериментальной верификации диагностически значимых маркеров может быть использован для выявления новых дифференциально метилированных сайтов и разработки новых подходов к неинвазивной диагностике ГЦК