Investigations of primary active transporters expressed in Xenopus laevis oocytes : Wilson Disease Protein, a p-type ATPase and Proteorhodopsin, a light driven proton pump

The present work wishes to contribute with information on two members of the primary active transporter group, which differ both in structure and function: Wilson Disease Protein which uses the energy released by ATP hydrolysis to transport copper across cell membranes, and Proteorhodopsin, which uses the energy of light to build up a proton gradient across the bacterial cell membrane, both heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. The surface detection experiments using HA-tagged WNDP confirm the proposed topology of WNDP. The HA-tag per se does not interfere with the function of WNDP, as shown for WNDP HA56 by ATP-dependent phosphorylation after expression in Sf9 cells. Sequence modifications within the WNDP HA56 template-construct reveal some interesting features: i) the N-terminal domain, which contains the 6 metal binding sites, is not necessary for plasma membrane targeting; ii) elevated surface expression of WNDP was observed when the carboxy terminus containing the tri-Leu motif is missing, which suggests that this motif might be involved in the retrieval of the protein from the plasma membrane; iii) the mutations TGE>AAA (proposed to lock the protein in the E1 conformation and lead to constitutive plasma membrane localisation) and D1027A (phosphorylation deficient) did not interfere with the surface localisation of the protein; iv) the mutations CPC>SPS (copper transport deficient) and H1069Q (phosphorylation deficient, most common mutation in Wilson Disease) reduced plasma membrane expression to less then 50%. Western blot analysis shows that the overall expression level of all constructs is similar to that of the reference construct WNDP HA56. These findings suggest that motifs involved in copper binding and catalytic activity do not interfere with plasma membrane targeting of WNDP in Xenopus oocytes. However, the H1069Q mutation could interfere with the distribution of WNDP protein within the cells. In the case of Proteorhodopsin, data presented in this work support earlier observations according to which proteorhodopsin can operate as an outwardly and inwardly directed light-driven ion pump. The residues proposed to play the roles of proton donor (E108) and acceptor (D97) are important for proton translocation. In the absence of an anionic residue at position 97 no outward pumping takes place, but inward charge translocation may occurs under appropriate conditions. An M-like state similar to that known from BR detectably accumulates under neutral pH conditions or under conditions where reprotonation of the Schiff base from the cytoplasmic side is slowed down, as in case of the mutants at position 108. Under acidic conditions PR pumps inwardly under the concerted action of pH and transmembrane potential. The experiments performed in parallel with PR and BR wild-types brought not only interesting information about similarities and differences between the two retinylidene ion pumps, but also led to the observation that the life-time of the M state in BR wild-type can be extended in addition to hyperpolarising transmembrane potentials also by extracellular acidic pH, when the proton gradient through the cell membrane is directed opposite to the ion transport (i.e. when the electrochemical gradient opposing the direction of proton transport increases). Direct photocurrent measurements of HA-tagged PR and BR have shown that the inserted tag may interfere with the functionality of the protein. Next to E108 and D97 in PR other residues in the vicinity of the retinal binding pocket contribute to the translocation of protons, as exemplified by the mutant L105Q: additionally to changing the absorption maximum of the protein, this mutant is a less effective proton pump than the wild type. The example of PR suggests that transduction of light energy by – and reaction mechanisms of retinylidene ion pumps have not been entirely deciphered by the extensive studies of bacteriorhodopsin.Die vorliegende Arbeit beinhaltet Experimente zum Studium zweier primär aktiver, in Membran lokalisierter Transportproteinen. Sie wurden heterolog in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert. Hierbei handelt es sich um eine Schwermetall-ATPase, das „Wilson Disease Protein“, und eine lichtgetriebene Protonenpumpe, „Proteorhodopsin“. Das „Wilson Disease Protein“ (WNDP) ist eine, aus 1465 Aminosäuren bestehende P1-Typ Cu+-ATPase, die wichtig ist, um während der Proteinsynthese im Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) Kupfer Ionen (Cu+) bereitzustellen, und im Falle einer Erhöhung des intrazellulärem Kupfer- Konzentrazion trägt, durch nicht ausreichend geklärten Mechanismen, zur Wiederherstellung des physiologischen Cu-Spiegels bei. Durch Mutationen bedingte Fehlfunktionen von WNDP führen zu der Erbkrankheit Morbus Wilson. Die vorliegende Arbeit versucht, die Xenopus-Oozyten – ein bekanntes System zum Studium von Transportproteinen der Plasmamembran – als ein alternatives Expressionssystem zu evaluiren. Die Experimente zeigen, dass das Wilson Disease Protein in Xenopus-Oozyten exprimiert werden kann. Es befindet sich in der Plasmamembran der Oozyten und kann durch Chemilumineszenz und Elektronenmikroskopie detektiert werden. Die Experimente zu Oberflächenexpression, bei denen mit HA-Epitopen markiertes WNDP verwendet wurde, bestätigen die für WNDP vorgeschlagene Topologie. Sequenzänderungen, die in das Konstrukt WNDP HA56 eingefügt wurden, offenbaren einige interessante Eigenschaften des Proteins: i) Die N-terminale Domäne, die 6 Metall-Bindestellen enthält, ist offensichtlich für die Zielsteurung in die Plasmamembran targeting nicht notwendig. ii) Bei fehlendem Carboxy-terminus – wodurch das triple-Leucin-Motiv deletiert wird – kommt es zu einer verstärkten Oberflächenexpression von WNDP, woraus sich Hinweise auf eine Beteiligung dieses Motives bei der Relokalisation des Proteins aus der Plasmamembran zum TGN ergeben. Ausserderm, die Resultate weisen darauf hin, dass die Motive, die für die Kupferbindung und die katalytische Aktivität wichtig sind in Xenopus-Oozyten, keinen Einfluss auf Zielsteuerung zur Plasmamembran von WNDP haben. Allerdings könnte die Mutation H1069Q mit der Verteilung von WNDP innerhalb der Zellen interferieren. Proteorhodopsin (PR), das erste “Bakterio-Rhodopsin“ im eigentlichen Sinne, ist eine lichtgetriebene, auswärtsgerichtete Protonenpumpe, die in Meeresbakterien identifiziert werden konnte. Das Protein besteht aus 249 Aminosäuren und zeigt eine erhebliche Sequenzähnlichkeit mit Bakteriorhodopsin (BR). Die entscheidenden Elemente für die Translokation der Protonen sind konserviert. Die Expression in Xenopus-laevis-Oozyten erlaubt nicht nur die Untersuchung des pHEinflusses auf perfekt orientierte PR Moleküle, sondern auch die des Membranpotentials (beide zusammen bilden das elektrochemische Potential für Protonen, ΔμH+). Wildtyp und PR-Mutanten wurden in diesem System heterolog exprimiert und untersucht, um mehr über die Faktoren, die die Eigenschaften des Protontransfers kontrollieren, zu erfahren. Mittels des Two-Electrode Voltage-Clamp Methode (Zwei-Elektroden Spannungsklemme), wurde das Aktionsspektrum vom PR Wildtyp aufgenommen und mit früheren Messungen an künstlichen Lipid Membranen (BLM) verglichen. Außerdem wurden die Spannungsabhängigkeit der stationären Photoströme von PR Wild-Typ (I-V Kennlinien) bei verschiedene intra- und extrazellulären pHWerten bestimmt. Mutationen der Proton-Akzeptor und –Donor-Gruppen D97 und E108 wurden ebenfalls auf ihre Auswirkungen untersucht. Stationäre Belichtung bei neutralem pH löst bei den Mutanten D97N und D97T nur transiente und stationäre Einwärtsströme, eine Tatsache, die die wichtige Rolle des Protonenakzeptors D97 für das Auswärtspumpen bestätigt. Die Mutante E108G zeigt im Vergleich zum Wild-Typ viel kleinere auswärts gerichtete transiente und stationäre Ströme. Die stationäre Pumpfunktion wird in Anwesenheit von Azid deutlich stimuliert, in Analogie zur BR Mutanten D96G. Die Lebenszeit des M-ähnlichen Intermediates von PR Wildtyp und E108G wurde mittels eines speziellen Belichtungsprotokolls studiert, und dabei BR Photoströme unter gleiche Bedingungen als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass während der stationären Belichtung bei pH 7.4 blaue Laserblitze deutliche auswärtsgerichtete transiente Ströme bei PR hervorrufen, im Gegensatz zu BR, was darauf hinweist, dass unter gleichen experimentellen Bedingungen immer noch weitere PRMoleküle angeregt werden können. Die Richtung der transienten Ladungstranslokation ist bei negativen Membranpotentialen invertiert (einwärtsgerichtet). Bei extrazellulär saurem pH konnten einwärtsgerichtete transiente Ströme sowohl bei blauen als auch bei grünen Laserblitzen beobachtet werden. Ein M-ähnlicher Zustand wie im Falle von BR kann spektroskopischen Messungen zufolge bei PR nur bei neutralem pH-Wert akkumulieren, oder unter Bedingungen unter denen die Reprotonierung der Schiff’schen Base von der zytoplasmatischen Seite her verlangsamt ist, wie im Fall der Mutationen des Protonendonors E108 (unterstüzt von den Experimenten mit PR E108G in der An- oder Abwesenheit von Azid, und unterschiedliche pH Werte). Diese Ergebnisse bestätigen die früheren Aussagen von Friedrich et al. (2002), dass die Richtung des Protonentransports durch den Protonenkonzentrationsgradienten und das Membranpotential bestimmt wird. Die Experimente, die parallel an PR- und BR-Wildtypen ausgeführt wurden, haben nicht nur interessante Informationen über Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Retinyliden- Ionenpumpen gebracht. Außerdem führten sie zu der Beobachtung, dass die Lebenszeit des M-Zustand in BR – außer durch hyperpolarisierende Membranpotentiale (Geibel et al, 2001) – auch durch einen der Richtung der Ionenpumpe entgegengesetzten Protonengradienten verlängert werden kann. Direkte Photostrom-Messungen von HA-Epitop markiertem PR und BR haben gezeigt, dass das HA-Epitop abhängig von der Insertionsstelle die Funktion des Proteins beeinträchtigen kann

Voltage dependence of proton pumping by bacteriorhodopsin mutants with altered lifetime of the M intermediate.

The light-driven proton pump bacteriorhodopsin (BR) from Halobacterium salinarum is tightly regulated by the [H(+)] gradient and transmembrane potential. BR exhibits optoelectric properties, since spectral changes during the photocycle are kinetically controlled by voltage, which predestines BR for optical storage or processing devices. BR mutants with prolonged lifetime of the blue-shifted M intermediate would be advantageous, but the optoelectric properties of such mutants are still elusive. Using expression in Xenopus oocytes and two-electrode voltage-clamping, we analyzed photocurrents of BR mutants with kinetically destabilized (F171C, F219L) or stabilized (D96N, D96G) M intermediate in response to green light (to probe H(+) pumping) and blue laser flashes (to probe accumulation/decay of M). These mutants have divergent M lifetimes. As for BR-WT, this strictly correlates with the voltage dependence of H(+) pumping. BR-F171C and BR-F219L showed photocurrents similar to BR-WT. Yet, BR-F171C showed a weaker voltage dependence of proton pumping. For both mutants, blue laser flashes applied during and after green-light illumination showed reduced M accumulation and shorter M lifetime. In contrast, BR-D96G and BR-D96N exhibited small photocurrents, with nonlinear current-voltage curves, which increased strongly in the presence of azide. Blue laser flashes showed heavy M accumulation and prolonged M lifetime, which accounts for the strongly reduced H(+) pumping rate. Hyperpolarizing potentials augmented these effects. The combination of M-stabilizing and -destabilizing mutations in BR-D96G/F171C/F219L (BR-tri) shows that disruption of the primary proton donor Asp-96 is fatal for BR as a proton pump. Mechanistically, M destabilizing mutations cannot compensate for the disruption of Asp-96. Accordingly, BR-tri and BR-D96G photocurrents were similar. However, BR-tri showed negative blue laser flash-induced currents even without actinic green light, indicating that Schiff base deprotonation in BR-tri exists in the dark, in line with previous spectroscopic investigations. Thus, M-stabilizing mutations, including the triple mutation, drastically interfere with electrochemical H(+) gradient generation