Miniaturization of a screening method to find novel inhibitors of E. coli efflux pumps

Tausta: Antibiootit ovat olleet tärkeä tekijä bakteeriperäisten infektiotautien kuolleisuuden romahduksessa 1900-luvulla. Bakteerit ovat kuitenkin erittäin tehokkaita mukautumaan ympäristönsä muutoksiin lyhyen elinkaarensa vuoksi. Näin ollen bakteerien antibioottiresistenssin kehitys on luonnollisesti seurannut valtavaa maailmanlaajuista antibioottien käyttöä. Nykyinen tilanne on, että bakteerien antibioottiresistenssi kehittyy nopeammin kuin uusia antibiootteja löydetään ja kehitetään. Gram-negatiivisten bakteerien kolme pääasiallista resistenssistrategiaa ovat: antibiootin kohderakenteen muokkaus, antibiootin entsymaattinen inaktivaatio ja solun sisäisen antibioottikonsentraation laskeminen ulkokalvon toimintaa muokkaamalla. Bakteerit laskevat solun sisäistä antibioottikonsentraatiota muun muassa efluksipumpuilla, joista merkittävimpiä antibioottiresistenssin kannalta ovat RND-perheen effluksipumput. RND-efluksipumput toimivat tyypillisesti osana kolmiosaista rakennetta, joka mahdollistaa antibioottien pumppaamisen solun ulkoiseen tilaan. RND-pumppuja vastaan on kehitetty useita inhibiittoreita, mutta yksikään ei ole saavuttanut lääkekehityksen kliinistä vaihetta. Tavoitteet: 384-kuoppalevyformaatissa toimivan seulontamenetelmän kehittäminen E. colin (BAA1161) efluksipumppuinhibiittorien seulomiseen, sekä kehitetyn menetelmän testaaminen. Menetelmät: Absorbanssimittauksen riittävän herkkyyden varmistaminen bakteerikannan (BAA1161) kasvun seurantaan 384-kuoppalevyformaatissa. Seulontamenetelmässä käytettävän antibiootin (piperasilliini) ja positiivisena kontrollina käytettävän efluksipumppuinhibiittorin (meflokiini) BAA1161 kasvua estävän konsentraation (MIC) määrittäminen sekä 96- että 384-kuoppalevyformaatissa. Piperasilliinin ja meflokiinin BAA1161:n kasvua estävän synergian varmistaminen 96- ja 384-kuoppalevyformaateissa checkerboard-menetelmällä. Sijainnin vaikutuksen selvittäminen 384-kuoppalevyllä. Korkeimman BAA1161:n kasvuun vaikuttamattoman DMSO-konsentraation määrittäminen 384-kuoppalevyformaatissa. 126 luontoperäisen yhdisteen seulominen 384-kuoppalevyillä kehitetyn menetelmän testaamiseksi. Seulonta suoritettiin neljällä rinnakkaisella näytteellä perustuen seulottavien yhdisteiden bakteerin kasvua estävään vaikutukseen piperasilliinin kanssa. Yhdisteille, jotka osoittivat seulonnassa BAA1161:n kasvua estävää vaikutusta, suoritettiin annos-vaste -kokeet sekä piperasilliinin kanssa että ilman 384-kuoppalevyllä. Tulokset ja pohdinta: Absorbanssimittaus osoittautui riittävän herkäksi menetelmäksi BAA1161:n kasvun mittaamiseen 384-kuoppalevyllä. 96- ja 384-kuoppalevyillä meflokiinin MIC-arvoksi saatiin 32 μg/ml. Piperasilliinin MIC-arvoksi saatiin 1024 μg/ml 96-kuoppalevyllä, mutta 384-kuoppalevyllä MIC-arvossa oli vaihtelua. Piperasilliini ja meflokiini osoittivat synergistista BAA1161:n kasvun estoa checkerboard-kokeissa. Kuopan sijainnin mahdollista vaikutusta menetelmän tuloksiin ei voitu arvioida, koska piperasilliinin vaikutuksessa BAA1161:n kasvuun oli suurta sattumanvaraista vaihtelua. Tämä sattumanvaraisesti toistuva ilmiö, jossa piperasilliini esti osassa kuoppia kokonaan tai lähes kokonaan BAA1161:n kasvun pitoisuudella joka oli alle MIC:n, toistui myös kaikissa seuraavissa kokeissa 384-kuoppalevyllä. Yksi mahdollinen syy tähän 384-kuoppalevyformaatissa toistuvaan ilmiöön on BAA1161 kannan heterogeenisyys piperasilliiniresistenssin suhteen. Testiseulonnassa neljä yhdistettä, jotka kaikki sisälsivät gallushappoesterin, osoittivat lupaavaa aktiivisuutta. Nämä yhdisteet olivat: epigallokatekiinigallaatti, hamamelitanniini, isopropyyligallaatti ja oktyyligallaatti. Hamamelitanniinin ja oktyyligallaatin teho osoittautui synergistiseksi piperasilliinin kanssa annos-vaste-kokeessa. Johtopäätökset: Kehitettyä menetelmää voidaan hyödyntää uusien efluksipumppuinhibiittorien seulontaan. Menetelmän jatkokehittäminen lienee kuitenkin järkevää piperasilliinin vaikutuksen vaihtelun poistamiseksi ja siten menetelmän luotettavuuden lisäämiseksi. Menetelmän kuoppalevyformaattia vaihdettaessa tulisi myös kiinnittää erityistä huomiota tekijöihin jotka saattavat vaikuttaa menetelmän toimivuuteen uudessa formaatissa. Testiseulonnan perusteella gallushappoesterit ovat kiinnostava yhdisteryhmä, joiden antibioottien tehoa lisäävää vaikutusta kannattanee tutkia lisää tulevaisuudessa.Background: Antibiotics have been an important factor in the dramatic decrease of infectious disease mortality in the 20th century. Bacteria are, however, very quick to respond to the changes in their environment because of their short life cycle. Thus, the development of bacterial antibiotic resistance is a natural consequence of the enormous worldwide antibiotic use. The current situation is that the antibiotic resistance develops faster than novel antibiotics are found and developed. The three main resistance strategies of Gram-negative bacteria are: modification of the antibiotic target, enzymatic inactivation of the antibiotic and reduce of the intracellular antibiotic concentration by changing the function of the outer membrane. To decrease the intracellular antibiotic concentration bacteria use efflux pumps. RND efflux pumps are the most important family of efflux pumps regarding antibiotic resistance. They typically function as a part of a tripartite structure which allows the efflux of antibiotics to the extracellular space. Multiple inhibitors have been developed against RND efflux pumps but none has reached the clinical stage of drug development. Objectives: Development and testing of a 384-well plate method for screening efflux pump inhibitors for E. coli (BAA1161) efflux pumps. Methods: Verifying that the absorbance measurement is a sensitive enough method for measuring the bacterial (BAA1161) growth in 384-well plate format. The antibiotic chosen to be used in the screening method was piperacillin and the positive control efflux pump inhibitor was mefloquine. Determining the minimum growth inhibiting concentrations (MICs) of piperacillin and mefloquine in 96- and 384-well plate formats. Verification of the synergistic growth inhibitory effect of piperacillin and mefloquine with the checkerboard method in 96- and 384-well plate formats. Determining the positional effect in the 384-well plate. Determining the highest DMSO concentration without effect on the growth of BAA1161. Screening of 126 natural compounds in 384-well plates to test the developed method. Screening was done in quadruplicates based on the growth inhibitory effect of the natural compounds when combined with piperacillin. Dose-response assay was conducted in combination with and without piperacillin with the compounds that showed growth inhibiting effect during screening. Results and discussion: Absorbance measurement was sensitive enough method for measuring the BAA1161 growth in the 384-well plate. MIC value of mefloquine was 32 μg/ml in both plate formats. Piperacillin’s MIC was 1024 μg/ml in the 96-well plate, but on the 384-well plate there was variation in the MIC. Piperacillin and mefloquine showed synergistic effect on BAA1161 growth inhibition in the checkerboard assays. Positional effect could not be determined, because of the variation in the BAA1161 growth inhibition effect of piperacillin. This randomly occurring phenomenon were piperacillin inhibited BAA1161 growth completely or almost completely with sub-MIC concentration was encountered in all the subsequent experiments in the 384-well plate format. One possible reason for this phenomenon, occuring in the 384-well plate format, could be piperacillin heteroresistance of BAA1161 strain. In the test screen, four compounds, which all included gallic acid ester, showed promising activity. These compounds were: epigallocatechin gallate, hamamelitannin, isopropyl gallate and octyl gallate. In the dose-response assay, hamamelitannin’s and octyl gallate’s effect was synergistic with piperacillin. Conclusions: The developed method can be used to screen novel efflux pump inhibitors. However, to increase the reliability of the method, further optimization is required to eliminate the variability in the effect of piperacillin. When plate format of a method is changed, factors which could affect the functionality of the method in the new format should be carefully assessed. Based on the test screed, gallic acid esters are interesting compounds which combined effects with antibiotics should be studied in the future experiments

Prolyl oligopeptidase inhibition reduces alpha-synuclein aggregation in a cellular model of multiple system atrophy

Multiple system atrophy (MSA) is a fatal neurodegenerative disease where the histopathological hallmark is glial cytoplasmic inclusions in oligodendrocytes, rich of aggregated alpha-synuclein (aSyn). Therefore, therapies targeting aSyn aggregation and toxicity have been studied as a possible disease-modifying therapy for MSA. Our earlier studies show that inhibition of prolyl oligopeptidase (PREP) with KYP-2047 reduces aSyn aggregates in several models. Here, we tested the effects of KYP-2047 on a MSA cellular models, using rat OLN-AS7 and human MO3.13 oligodendrocyte cells. As translocation of p25α to cell cytosol has been identified as an inducer of aSyn aggregation in MSA models, the cells were transiently transfected with p25α. Similar to earlier studies, p25α increased aSyn phosphorylation and aggregation, and caused tubulin retraction and impaired autophagy in OLN-AS7 cells. In both cellular models, p25α transfection increased significantly aSyn mRNA levels and also increased the levels of inactive protein phosphatase 2A (PP2A). However, aSyn or p25α did not cause any cellular death in MO3.13 cells, questioning their use as a MSA model. Simultaneous administration of 10 µM KYP-2047 improved cell viability, decreased insoluble phosphorylated aSyn and normalized autophagy in OLN-AS7 cells but similar impact was not seen in MO3.13 cells.Peer reviewe

Prolyl oligopeptidase inhibition reduces alpha-synuclein aggregation in a cellular model of multiple system atrophy

Multiple system atrophy (MSA) is a fatal neurodegenerative disease where the histopathological hallmark is glial cytoplasmic inclusions in oligodendrocytes, rich of aggregated alpha-synuclein (aSyn). Therefore, therapies targeting aSyn aggregation and toxicity have been studied as a possible disease-modifying therapy for MSA. Our earlier studies show that inhibition of prolyl oligopeptidase (PREP) with KYP-2047 reduces aSyn aggregates in several models. Here, we tested the effects of KYP-2047 on a MSA cellular models, using rat OLN-AS7 and human MO3.13 oligodendrocyte cells. As translocation of p25 alpha to cell cytosol has been identified as an inducer of aSyn aggregation in MSA models, the cells were transiently transfected with p25 alpha. Similar to earlier studies, p25 alpha increased aSyn phosphorylation and aggregation, and caused tubulin retraction and impaired autophagy in OLN-AS7 cells. In both cellular models, p25 alpha transfection increased significantly aSyn mRNA levels and also increased the levels of inactive protein phosphatase 2A (PP2A). However, aSyn or p25 alpha did not cause any cellular death in MO3.13 cells, questioning their use as a MSA model. Simultaneous administration of 10 mu M KYP-2047 improved cell viability, decreased insoluble phosphorylated aSyn and normalized autophagy in OLN-AS7 cells but similar impact was not seen in MO3.13 cells