Mikrosienten D-galakturonaattireitin metabolian muokkaus

Industrial biotechnology is one of the enabling technologies for biorefineries, where biomass is converted into value-added products. In addition to biofuels, several platform and fine chemicals can be produced from biomass using biotechnological routes taking advantage of metabolic pathways in the cell. Some of these metabolic pathways exist naturally in the cells that are used as production hosts. However, many of the desired chemical products are not naturally produced by the cellular metabolism. Consequently, genetic engineering is needed to redirect the cellular metabolism towards a product of interest. In this thesis, one of these metabolic pathways – the catabolic D-galacturonate pathway in filamentous fungi – was engineered and redirected to desired end products. D-Galacturonic acid is the main monomer of pectin, which is a common heteropolysaccharide in certain biomasses. Two examples of pectin-rich biomasses are citrus processing waste and sugar beet pulp from agro-industry. These residual biomasses are often poorly utilised. Biotechnological production of L-galactonic acid, a potential platform chemical, was demonstrated in this thesis for first time. The production was obtained in Aspergillus niger and Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) strains by deleting the second gene, encoding a dehydratase, from the fungal D-galacturonate pathway. Overexpression of the first gene, encoding a D-galacturonate reductase, in the pathway improved the initial production rate in A. niger. In addition, production at low pH resulted in higher productivity and titres in cultivations with the engineered A. niger strains. Final titres between 7 and 9 g L-galactonic acid l-1 and product yields close to 100% were observed from pure D-galacturonic acid with both of the production hosts. In addition to L-galactonic acid production from pure D-galacturonic acid, a consolidated bioprocess from citrus processing waste, a pectin-rich biomass, to L-galactonic acid was investigated using the engineered strains of A. niger. Two different bioprocess types, submerged and solid state fermentation, were compared. As a result, similar final titres and product yields were observed to those obtained in the process from pure D-galacturonic acid. The highest product yield, approaching 90% of the theoretical maximum, was achieved in the solid state fermentation. The second reaction in the fungal D-galacturonate pathway is dehydration of L-galactonic acid by the action of an L-galactonate dehydratase. Deletion of the gene gaaB encoding this enzyme in A. niger is crucial for L-galactonic acid production. Despite the deletion of gaaB, product yields (L-galactonic acid per consumed D-galacturonic acid) have remained below the theoretical maximum. In addition, catabolisation of mucic acid, an industrially potential dicarboxylic acid that can be produced via an engineered D-galacturonate pathway, has been observed in the earlier studies. We hypothesised that catabolisation of L-galactonic acid and mucic acid may be due to other dehydratases. For these reasons, all the five putative dehydratase-encoding genes from A. niger were expressed in yeast and the resulting enzymes were characterised. The current study revealed the substrate specifities for four of the studied dehydratases, whereas one of the putative dehydratases was apparently not in fact an active dehydratase. In addition to GaaB, two dehydratases with activity towards D-galactonic acid and one with activity towards L-rhamnonic acid were identified. GaaB was the only dehydratase with activity towards L-galactonic acid. Although GaaB has broad substrate specificity, neither it nor any other dehydratase showed activity towards mucic acid or its lactone. In summary, undesired L-galactonic acid or mucic acid catabolisation was not explained by these dehydratases. L-Galactonate-5-dehydrogenase, a bacterial enzyme oxidising L-galactonic acid to D-tagaturonic acid, was also studied in this thesis. This enzyme activity has been demonstrated earlier from crude extract of Escherichia coli. Later on, the corresponding gene encoding the enzyme was suggested to be yjjN, although without characterisation of the enzyme. In this work, it was shown that yjjN does indeed encode an L-galactonate-5-dehydrogenase. The Km and kcat for L-galactonic acid were 19.5 mM and 0.51 s-1, respectively. In addition, the YjjN enzyme was applied in a colorimetric assay for L-galactonic and L-gulonic acids with detection limits of 1.65 μM and 10 μM, respectively. L-Galactonic acid can be lactonised and further oxidised to L-ascorbic acid (vitamin C) via chemical or biochemical routes. Synthetic L-ascorbic acid is widely used as a nutrient and preservative in several industries. Currently, it is produced in a process combining chemical and biochemical steps. In this thesis, an A. niger strain was engineered for direct conversion of D-galacturonic acid to L-ascorbic acid. In addition to the deletion of gaaB, two heterologous genes, encoding L-galactono-1,4-lactone lactonase and L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase from a plant biosynthetic L-ascorbic acid pathway, were introduced into A. niger. In addition, a gene encoding an unspecific L-gulono-1,4-lactone lactonase from a mammalian biosynthetic L-ascorbic acid pathway was tested instead of the plant lactonase. The lactonase enzyme activity was not observed in any of the engineered A. niger strains. However, the resulting strains were capable of L-ascorbic acid production from pure D-galacturonic acid or citrus processing waste with final titres up to 170 mg l-1. Pectin-rich biomass has potential as a raw material for the production of renewable chemicals. This thesis presents new ways to utilise this residual biomass by using industrial biotechnology. In addition, the thesis broadens basic understanding of the fungal catabolic D-galacturonate pathway and how it can be engineered for production of useful chemicals.Teollinen biotekniikka on yksi tärkeistä teknologioista, jotka mahdollistavat biomassan jalostamisen erilaisiksi lopputuotteiksi. Bioteknologiaa käyttäen biomassasta voidaan biopolttoaineiden lisäksi tuottaa useita eri kemikaaleja hyödyntämällä solujen metaboliareittejä. Osa näistä hyödyllisistä metaboliareiteistä on luonnostaan soluissa. Sen sijaan osa halutuista lopputuotteista ei syntetisoidu luonnostaan tuotto-organismeissa solujen metaboliareittien kautta. Näissä tapauksissa voidaan hyödyntää solujen geneettistä muokkausta, jotta solun metabolia saadaan ohjattua halutun yhdisteen tuottamiseen. Tässä työssä yksi solun metaboliareitti – mikrosienten D-galakturonihapon kataboliareitti – oli geneettisen muokkauksen kohteena ja se ohjattiin haluttujen yhdisteiden tuottoon. D-galakturonihappo on pektiinin pääkomponentti. Pektiini taas on yleinen kasvibiomassan heteropolysakkaridi. Sitrushedelmien ja sokerijuurikkaan prosessoinnista jäljelle jäävät kuori- ja puristusjäte ovat esimerkkejä pektiinipitoisista biomassoista. Nämä jäännösbiomassat ovat usein vajavaisesti hyödynnettyjä. L-galaktonihappo on kemikaali, jota voidaan potentiaalisesti hyödyntää moniin eri tarkoituksiin. Tässä työssä sen bioteknologinen tuotanto osoitettiin ensimmäisen kerran hyödyntäen Aspergillus niger ja Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) -homeita, joista D-galakturonihapporeitin toinen, dehydrataasientsyymiä koodaava geeni oli poistettu. D-galakturonihapporeitin ensimmäisen, D-galakturonihapporeduktaasia koodaavan geenin ekspressointi paransi alkuvaiheen tuottonopeutta A. niger -homeessa. Lisäksi matala pH paransi tuottoa muokatuissa A. niger -kannoissa. Puhtaasta D-galakturonihaposta saavutettiin parhaimmillaan 7–9 g l-1 L-galaktonihapon tuotto saannon ollessa lähellä 100 %. L-galaktonihapon tuoton lisäksi tämän työn tutkimuskohteena oli bioprosessi suoraan pektiinipitoisesta biomassasta L-galaktonihapoksi. Kahta eri bioprosessityyppiä, nestemäistä ja kiinteän tilan kasvatusta, vertailtiin käyttäen muokattuja A. niger -kantoja. L-galaktonihapon loppupitoisuudet ja saannot pektiinipitoisesta biomassasta olivat verrannollisia arvoihin, joita saavutettiin puhtaasta D-galakturonihaposta. Korkein saanto, joka oli lähes 90 % teoreettisesta maksimista, saavutettiin kiinteän tilan prosessissa. Sienien D-galakturonihapon kataboliareitin toinen reaktio on L-galaktonihapon dehydratointi L-galaknonihappodehydrataasientsyymillä. Kyseistä entsyymiä koodaavan geenin deleetio on välttämätön L-galaktonihapon tuoton saavuttamiseksi. Deleetiosta huolimatta saannot (tuotettu L-galaktonihappo per kulutettu D-galakturonihappo) ovat jääneet alle teoreettisen maksimiarvon. Tämän lisäksi toisen D-galakturonihaposta tuotettavan yhdisteen, teollisesti potentiaalisen kemikaalin galaktaarihapon on havaittu katabolisoituvan sen tuottoon muokatuissa A. niger -kannoissa. Tässä työssä hypoteesinä edellä mainittujen yhdisteiden ei-toivotulle katabolialle olivat mahdolliset muiden dehydrataasientsyymien reaktiot. Näin ollen kaikki viisi putatiivista dehydrataasigeeniä A. nigerin genomista ekspressoitiin hiivassa ja niiden proteiinituotteiden dehydrataasiaktiivisuudet karakterisoitiin. Entsyymikarakterisoinnin avulla määritettiin neljän dehydrataasin substraattispesifisyydet, kun taas yksi putatiivisista dehydrataasigeeneistä ei todennäköisimmin koodaa toiminnallista dehydrataasia. GaaB-L-galaktonihappodehydrataasin lisäksi identifioitiin kaksi dehydrataasia, joilla on aktiivisuus D-galaktonihappoa, ja yksi dehydrataasi, jolla on aktiivisuus L-rhamnonihappoa kohtaan. GaaB oli ainoa tutkituista dehydrataaseista, jolla oli aktiivisuus L-galaktonihappoa kohtaan. Yhdelläkään tutkituista dehydrataaseista ei ollut aktiivisuutta limahappoa tai sen laktonimuotoa kohtaan. Näin ollen L-galaktonihapon ja limahapon kataboliaa ei voitu yhdistää tutkittuihin dehydrataaseihin. L-galaktonihappo-5-dehydrogenaasi on bakteereissa esiintyvä entsyymi, joka hapettaa L-galaktonihapon D-tagaturonihapoksi. Tämän entsyymin aktiivisuus on aikaisemmissa tutkimuksessa osoitettu Escherichia coli -bakteerin soluekstraktista. Myöhemmin kyseisen entsyymin ehdotettiin olevan yjjN-geenin koodaama, mutta kyseisessä tutkimuksessa ei karakterisoitu geenin koodaamaa proteiinia. Tässä työssä osoitettiin, että yjjN-geeni koodaa todellakin L-galaktonihappo-5-dehydrogenaasia. Km ja kcat -arvoiksi L-galaktonihappoa kohtaan määritettiin 19,5 mM ja 0,51 s-1. Tämän lisäksi YjjN-entsyymiä hyödynnettiin kolorimetrisessä analyysimenetelmässä L-galaktoni- ja L-gulonihapon pitoisuuksien määrittämiseen. Havaittavien pitoisuuksien alarajaksi määritettiin L-galaktonihapolle 1,65 μM ja L-gulonihapolle 10 μM. L-galaktonihappo voidaan laktonisoida ja edelleen hapettaa L-askorbiinihapoksi (vitamiini C) käyttäen kemiallisia tai biokemiallisia reaktioita. Synteettinen L-askorbiinihappo on laajalti käytössä ravinteena ja säilöntäaineena eri teollisuudenaloilla. Tällä hetkellä käytössä oleva valmistusmenetelmä yhdistää useita kemiallisia ja biokemiallisia vaiheita. Tässä työssä A. niger -home muokattiin tuottamaan L-askorbiinihappoa D-galakturonihaposta. gaaB-geenin poistamisen lisäksi kasvien L-askorbiinihapon synteesireitiltä ekspressoitiin L-galaktono-1,4-laktoni laktonaasia ja L-galaktono-1,4-laktoni dehydrogenaasia koodaavat geenit A. nigerissä. Vaihtoehtoisesti epäspesifi L-gulono-1,4-laktoni laktonaasia koodaava geeni eläinten L-askorbiinihapon synteesireitiltä ekspressoitiin kasviperäisen laktonaasin sijasta. Laktonaasientsyymiaktiivisuutta ei pystytty kuitenkaan havaitsemaan yhdestäkään muokatuista A. niger -kannoista. Tästä huolimatta kannat pystyivät tuottamaan L-askorbiinihappoa puhtaasta D-galakturonihaposta tai sitrushedelmien prosessijäännösbiomassasta. Korkein havaittu L-askorbiinihapon pitoisuus kasvatuksissa oli 170 mg l-1. Pektiinipitoinen biomassa on potentiaalinen uusiutuva raaka-aine kemikaalien tuottamiseksi. Tämä väitöskirja tuo esille uusia tapoja, joilla jäännösbiomassa voidaan hyödyntää entistä tehokkaammin käyttäen teollista bioteknologiaa. Lisäksi väitöskirja laajentaa perusymmärrystä sienien D-galakturonihapon metaboliareitistä ja siitä, kuinka sitä voidaan muokata tuottamaan hyödyllisiä kemikaaleja

Engineering a filamentous fungus for l-rhamnose extraction

l-Rhamnose is a high value rare sugar that is used as such or after chemical conversions. It is enriched in several biomass fractions such as the pectic polysaccharides rhamnogalacturonan I and II and in naringin, hesperidin, rutin, quercitrin and ulvan. We engineered the filamentous fungus Aspergillus niger to not consume l-rhamnose, while it is still able to produce the enzymes for the hydrolysis of l-rhamnose rich biomass. As a result we present a strain that can be used for the extraction of l-rhamnose in a consolidated process. In the process the biomass is hydrolysed to the monomeric sugars which are consumed by the fungus leaving the l-rhamnose

Clustered genes encoding 2-keto-L-gulonate reductase and L-idonate 5-dehydrogenase in the novel fungal D-glucuronic acid pathway

D-Glucuronic acid is a biomass component that occurs in plant cell wall polysaccharides and is catabolized by saprotrophic microorganisms including fungi. A pathway for D-glucuronic acid catabolism in fungal microorganisms is only partly known. In the filamentous fungus Aspergillus niger, the enzymes that are known to be part of the pathway are the NADPH requiring D-glucuronic acid reductase forming L-gulonate and the NADH requiring 2-keto-L-gulonate reductase that forms L-idonate. With the aid of RNA sequencing we identified two more enzymes of the pathway. The first is a NADPH requiring 2-keto-L-gulonate reductase that forms L-idonate, GluD. The second is a NAD(+) requiring L-idonate 5-dehydrogenase forming 5-keto-gluconate, GluE. The genes coding for these two enzymes are clustered and share the same bidirectional promoter. The GluD is an enzyme with a strict requirement for NADP(+)/NADPH as cofactors. The k(cat) for 2-keto-L-gulonate and L-idonate is 21.4 and 1.1 s(-1), and the K(m) 25.3 and 12.6 mM, respectively, when using the purified protein. In contrast, the GluE has a strict requirement for NAD(+)/NADH. The k(cat) for L-idonate and 5-keto-D-gluconate is 5.5 and 7.2 s(-1), and the K(m) 30.9 and 8.4 mM, respectively. These values also refer to the purified protein. The gluD deletion resulted in accumulation of 2-keto-L-gulonate in the liquid cultivation while the gluE deletion resulted in reduced growth and cessation of the D-glucuronic acid catabolism