Isolation and characterization of strong gene regulatory sequences from apple, Malus x domestica

For the strong expression of genes in plant tissue, the availability of specific gene regulatory sequences is desired. We cloned promoter and terminator sequences of an apple (Malus x domestica) ribulose biphosphate carboxylase small subunit gene (MdRbcS), which is known for its high expression and used gus reporter gene expression to test the regulatory activity of the isolated promoter and terminator sequences in transgenic tobacco. The MdRbcS promoter itself seemed to be less strong than the CaMV35S promoter when both used in combination with the nos terminator. However, the combination of the promoter and terminator of MdRbcS was able to drive gus to similar expression levels as the reference construct with CaMV35S promoter and nos terminator. This observation indicates the importance of the terminator sequence for gene expression. It is concluded that the combination of the MdRbcS promoter and terminator is a suitable regulatory sequence set for the expression of transgenes to a high level in plants and for intragenesis in apple specificall

Het op de markt brengen van een gentech siergewas; virtuele casussen

Het doel van dit project was om na te gaan wat er bij komt kijken om een genetisch gemodificeerd siergewas te vermarkten. Het idee bestaat bij betrokken partijen in de wetenschap en bij het bedrijfsleven dat vermarkting voor GM siergewassen makkelijker en sneller en daarmee goedkoper zou moeten kunnen zijn dan voor GM voedsel- of veevoedergewassen. In de Europese Unie is er reeds sprake van een precedent; er zijn enkele GM anjer cultivars tot de EU markt toegelaten voor import en processing, maar niet voor teelt! Om het doel van dit project te realiseren zijn er twee virtuele casussen geformuleerd die verder zijn onderzocht. In verband met de ingewikkeldheid van de materie is in de loop van dit project besloten om het werk te concentreren op één van de casussen, namelijk degeen die het dichtst bij realisatie is en waarvan invulling en uitwerking van de casus het concreetst gemaakt kon worden. Dit betrof de casus van een genetisch gemodificeerde lelie met geïntroduceerde resistentiegenen tegen bladluizen als overbrenger van virussen. Aan de hand van de GM anjer-dossiers is informatie verzameld en doorgesproken met het Bureau Genetisch Gemodificeerde Organismen. Vervolgens is het op de webpagina van het BGGO aanwezige formulier voor het aanvragen van markttoelating inclusief teelt ingevuld voor de specifieke virtuele siergewas-casus. Het BGGO was bereid deze aanvraag te bestuderen en te becommentariëren. Hieruit bleek dat er geen actueel uitgebreid aanvraagformulier voor markttoelatingen beschikbaar is op dit moment en dat het ingevulde formulier slechts een samenvattingsformulier was. Ook ontbrak de nodige concrete informatie als gevolg van het feit dat het een virtuele aanvraag betrof en daarmee bepaalde specifieke informatie niet gegeven kon worden, zoals bijvoorbeeld de moleculaire analyse van de lijn waarvoor de toelating werd gevraagd. Daarnaast bleek er veel onduidelijkheid over bepaalde typen informatie die in het commentaar gevraagd werden. De minimale eisen die aan een gewas worden gesteld bleken niet helder. Er werd verwezen naar de uitgebreide GM anjer aanvraag opgesteld door Florigene, maar er kon niet aangegeven worden wat er van de door Florigene aangeleverde informatie nu vanuit de overheid werd gevraagd en wat op eigen initiatief was aangeleverd. De onduidelijkheden in de procedure kunnen heel goed als consequentie hebben dat een aanvraag te veel tijd in beslag zou gaan nemen en dat daardoor en door eventueel nog uit te voeren tests en toetsen de kosten die met een aanvraag voor markttoelating gemoeid zijn voor de siersector te hoog zouden oplopen. Het was duidelijk dat een virtuele aanvraag verder niet zou bijdragen aan het verkrijgen van inzicht in de (on)mogelijkheden van markttoelating voor siergewassen. Daarom is er besloten om een formele aanvraag voor introductie in het milieu veldproef categorie 1 op te stellen en in te dienen voor de GM lelies, die inmiddels daadwerkelijk zijn geproduceerd en dus niet meer virtueel zijn. Dit zal moeten gebeuren binnen een vervolgprojec

Virtuele casus gentech siergewassen, fase 1 : PT14661, een vervolgproject van PT13973

Om in Europa genetisch gemodificeerde siergewassen te kunnen verkopen is toestemming nodig van de competente autoriteiten binnen de EU. Hiervoor is een traject nodig van aanvragen voor veldproeven in meerdere categorieën en tot slot de aanvraag voor marktintroductie. Om duidelijkheid te verkrijgen over de benodigde informatie voor een siergewas is besloten om een conceptaanvraag veldproef categorie 1 op te stellen met als voorbeeld merker-vrije gentech lelies met resistentie tegen bladluizen. Deze conceptaanvraag is doorgesproken met vertegenwoordigers van Bureau GGO en het COGEM secretariaat. Hiermee is meer duidelijkheid verkregen over informatie die nodig is voor categorie 1 en voor verdere aanvraag categorieën en voor marktintroductie

Oriental lily hybrids engineered to resist aphid attack

Establishing in vitro bulb scale cultures of lily cultivars followed by callusing and regeneration after gene transfer was found to be not very successful in our hands, except for ‘Snow Queen’. Identifying a more generally applicable system to generate callus with the ability to regenerate and amenable to Agrobacterium-mediated gene transfer was the goal of the research described here. Callus was induced on style and filament explants of 26 cultivars of lily. The cultivars were chosen from the hybrid groups longiflorum, asiatics and orientals of the genus Lilium but also interspecific hybrids were represented. Most cultivars were diploids but some were of triploid level and one was tetraploid. In general once callus was induced, it could relatively easily be maintained and propagated for further use. Regeneration was observed on both callus types from all cultivars tested with an efficiency ranging from 40 to 100%. Gene transfer as demonstrated by positive reporter gene uidA activity was found in all cultivars tested. Transgenic plants could be obtained in the first series of transformations and the applicability of a marker-free system was proven in lily. The protocol can now be used for the introduction of genes aiming at conferring resistance to aphids

Inheritance of determinants of flower colour in tetraploid roses

The choice of selection breeding for crop improvement in cut roses requires a better understanding of biological mechanisms and knowledge of the inheritance of the major target traits which can lead to new or improved screening methods. Colour is still the most important trait in cut roses. A tetraploid mapping population will be characterized for flower colour, by using colour charts such as the official chart of the Royal Horticultural Society, and additionally, by image analysis and measuring reflectance using a spectrocolorimeter. The genetics of flower colour will be studied. In addition, flower petals of all genotypes will be analysed by HPLC to characterize secondary metabolic components that determine flower colour, such as anthocyanins. The inheritance of these components will also be assessed and compared to that of flower colour. Preliminary results show that the most effective method to quantify colour is by HPLC analysis of the extracted anthocyanins. The highest pelargonidin concentrations occur at relatively low cyanidin concentrations. Absorbance and reflectance measurements illustrate the accumulated effect of all the individual antho¬cyanins present in the peta

Development of cisgenic apples with durable resistance to apple scab

Most of the apple (Malus × domestica) growers are facing serious disease problems with apple scab which is caused by the fungus Venturia inaequalis. Developing a resistant variety in apple through classical breeding is very slow and inefficient. So, we aim at improving existing apple varieties through a new concept called “cisgenesis” which saves time and effort compared to classical breeding. Malus floribunda proved to be a good source of natural scab resistance genes. The genes HcrVf1 and HcrVf2, consisting of promoter, coding and terminator sequences in their natural configuration, were isolated from Malus floribunda and cloned into the binary vector pMF1. Apple cv. ‘Gala’ was transformed with pMF1 containing HcrVf1 and HcrVf2, individually or in combination. pMF1 can be used to obtain marker-free plants by recombinase-based excision of a fragment carrying undesired gene sequences, such as antibiotic-selection marker genes, leaving behind only the gene(s)-of-interest and one recombination site. Using this vector it is therefore possible to stack several genes by retransformation using the same selection procedure. In order to obtain durable resistance, we have the intention to combine different resistance genes from Malus either by stacking them one by one or by introducing them all together in one T-DNA. Performance of all different types of cisgenic plants will be evaluated by monitoring scab resistance levels phenotypically and by determining gene expression profiles through quantitative RT-PC

Tegengaan van kwaliteitsverlies door stress bij weefselkweek

Het onderzoek in dit project betrof stress bij planten gerelateerd aan aspecten van weefselkweek. Door de invloed van deze stress op kwaliteit en kwantiteit van de geproduceerde planten leiden in vitro vermeerderingsbedrijven grote verliezen. In deze publicatie verslag van onderzoek bij de zandraket, Arabidopsis thaliana, hét modelgewas bij uitstek in het moleculair genetische onderzoek bij planten. Daarnaast werden enkele commerciële gewassen bestudeerd

Specific mapping of disease resistance genes in tetraploid cut roses

Control of fungal diseases is a major constraint of cut-rose cultivation in greenhouses and in transportation around the world. Therefore, development of resistant cultivars is a promising way to reduce the use of chemicals required for controlling the diseases. Genetic analyses and breeding for resistance, however, are hampered by the high degree of heterozygosity and the polyploid nature of cultivated roses. Nucleotide-binding site (NBS) profiling of Van der Linden et al. (2004) was used as a tool enabling a more directed way of studying the genetics of resistance to pathogens responsible for diseases such as powdery mildew. NBS profiling is a multiplex screening technique, producing amplified resistance gene (R-gene) and resistance gene analogue (RGA) fragments by using degenerated primers based on the conserved motifs present in the NBS domain of resistance genes. Since RGAs are abundantly distributed and highly polymorphic within the plant genome, NBS profiling generates multiple markers of putative resistance genes. Twelve NBS degenerated primer/ restriction enzyme combinations were used to genotype the whole rose tetraploid K5 population (Yan, 2005) and its parents. To generate RGA profiles, the restriction enzymes: AluI, HaeIII, Mse and RsaI were used in combination with degenerated primers NBS1, NBS3, and NBS5a6. The profiles were dominantly scored resulting in 106 polymorphic RGA markers which segregated in a 1:1 or 3:1 ratio. Uni-and bi-parental simplex markers will be mapped on the two available AFLP/SSR K5 maps (Yan, 2005) with Joinmap 4.0. The resulting parental tetraploid maps will be used to dissect the genetic variation for resistance to powdery mildew resistance. Additional Rosaceae SSRs mentioned in the literature are currently tested on the K5 population to obtain allelic bridges between the tetraploid and diploid genetic maps in rose and related species in order to align them. These bridges will improve cross-ploidy comparisons in roses in order to strengthen cut rose breedin