Untersuchung neuartiger Disulfid-Addukte aus humanem Plasma als Biomarker zum Nachweis einer Vergiftung mit phosphororganischen Cholinesteraseinhibitoren

Die Verifikation einer vermuteten Vergiftung mit phosphororganischen Verbindungen ist aus völkerrechtlichen, politischen sowie toxikologischen Gesichtspunkten von großem Interesse und stellt nach wie vor eine Herausforderung für die forensische Analytik dar. Um die betreffende Verbindung auch noch Tage bis Wochen nach einer Exposition nachweisen zu können, kommen zunehmend kovalente Addukte mit körpereigenen Proteinen als Langzeit-Biomarker zum Einsatz. Eine eindeutige Identifizierung ist dabei allerdings nur möglich, sofern sowohl der Phosphyl-Rest als auch die zugehörige Abgangsgruppe der phosphororganischen Verbindung analytisch erfasst werden. Während Addukte zwischen dem Phosphyl-Rest und nukleophilen Aminosäure-Resten in körpereigenen Proteinen bereits bekannt sind und standardmäßig in der Verifikationsanalytik eingesetzt werden, fehlen derartige Daten für die zugehörigen Abgangsgruppen. Ziel der vorliegenden Dissertation war daher die Identifizierung von Disulfid-Addukten zwischen thiolhaltigen Abgangsgruppen und verschiedenen Plasmakomponenten als neue Klasse von potentiellen Langzeit-Biomarkern. Nach Inkubation von gereinigtem humanem Serumalbumin (HSA) und Plasma mit den V-Typ Nervenkampfstoffen VX, CVX und RVX konnten nach enzymatischer Spaltung mit Pronase CysPro Dipeptide detektiert werden, die mit den zugehörigen Abgangsgruppen über Disulfidbrücken verbunden waren. Der Einsatz von microbore Flüssigchromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie erlaubte dabei die hochselektive und hochsensitive Detektion dieser neuartigen Disulfid-Addukte sowie die simultane Erfassung von bereits etablierten Tyrosin-Addukten. Mithilfe eigens hierfür synthetisierter Peptidstandards konnten zudem MetProCys- und AspIleCys-Tripeptid-Disulfid-Addukte identifiziert werden. Hierdurch wurde gleichzeitig die Fähigkeit der thiolhaltigen Abgangsgruppen zur Öffnung von intramolekularen Disulfidbrücken in Proteinen deutlich. Die Bestimmung der Nachweisgrenzen der V-Stoffe in Plasma anhand international anerkannter Vorgaben der Organisation für das Verbot Chemischer Waffen demonstrierte zudem die Anwendbarkeit der entwickelten Methodik bei toxikologisch relevanten Plasmakonzentrationen. Analog zu den Nervenkampfstoffen konnte die Übertragbarkeit der Bildung von Disulfid-Addukten anhand der beiden Verbindungen Oxydemeton-S-methyl und dessen Hauptmetaboliten Demeton-S-methyl sulfon auf phosphororganische Pestizide gezeigt werden. Abgesehen von HSA-Disulfid-Addukten konnten außerdem Disulfid-Addukte mit freiem Cystein/Cystin erstmalig nachgewiesen werden. Durch Untersuchung von Plasmaproben eines realen Vergiftungsfalls mit Oxydemeton-S-methyl konnte abschließend die Eignung der beschriebenen Disulfid-Addukte als Biomarker zum Nachweis einer Vergiftung mit phosphororganischen Verbindungen belegt werden.Verification of an alleged intoxication with organophosphorus compounds is of great legal, political and toxicological interest but still represents a challenging task for forensic analysis. In order to provide proof of poisoning days or even weeks post-exposure covalent adducts with endogenous proteins are increasingly used as long-term biomarkers. However, unambiguous identification is only feasible if both the phosphyl moiety as well as the leaving group of the respective organophosphorus compound is covered. Whereas adducts between the phosphyl moiety and nucleophilic amino acid residues in endogenous proteins have already been known and are used for verification by default, such data are missing for the corresponding leaving groups. Therefore, the aim of the present thesis was to identify disulfide-adducts between thiol-containing leaving groups and different plasma components as a new class of potential long-term biomarkers. Upon incubation of neat human serum albumin (HSA) and plasma with the V-type nerve agents VX, CVX and RVX followed by enzymatic proteolysis using pronase CysPro dipeptides could be detected that were linked to the corresponding leaving groups via disulfide bridges. Microbore liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry allowed highly selective and sensitive detection of these novel disulfide-adducts together with already established tyrosine-adducts for unambiguous identification of the respective organophosphorus compound. Moreover, MetProCys- and AspIleCys-tripeptide-disulfide-adducts were identified using peptide reference material that was synthesized exclusively for this purpose. Notably, detection of tripeptide-disulfide-adducts clearly showed the ability of thiol-containing leaving groups to open intramolecular disulfide bridges in proteins. Limits of detection for V-type nerve agents in plasma were determined according to the guidelines of the Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons and the applicability of the developed method to toxicologically relevant plasma concentrations was demonstrated. Using the two compounds oxydemeton-S-methyl and its main biotransformation product demeton-S-methyl sulfone it was shown that the formation of disulfide-adducts does not only occur with nerve agents but also with organophosphorus pesticides. Moreover, in addition to HSA-disulfide-adducts it was also possible to detect disulfide-adducts with free cysteine/cystine for the first time. Finally, analyzing plasma samples of a genuine case of intoxication with oxydemeton-S-methyl the suitability of the described disulfide-adducts as biomarkers for verification of an alleged exposure to organophosphorus compounds was demonstrated

Untersuchung neuartiger Disulfid-Addukte aus humanem Plasma als Biomarker zum Nachweis einer Vergiftung mit phosphororganischen Cholinesteraseinhibitoren

Die Verifikation einer vermuteten Vergiftung mit phosphororganischen Verbindungen ist aus völkerrechtlichen, politischen sowie toxikologischen Gesichtspunkten von großem Interesse und stellt nach wie vor eine Herausforderung für die forensische Analytik dar. Um die betreffende Verbindung auch noch Tage bis Wochen nach einer Exposition nachweisen zu können, kommen zunehmend kovalente Addukte mit körpereigenen Proteinen als Langzeit-Biomarker zum Einsatz. Eine eindeutige Identifizierung ist dabei allerdings nur möglich, sofern sowohl der Phosphyl-Rest als auch die zugehörige Abgangsgruppe der phosphororganischen Verbindung analytisch erfasst werden. Während Addukte zwischen dem Phosphyl-Rest und nukleophilen Aminosäure-Resten in körpereigenen Proteinen bereits bekannt sind und standardmäßig in der Verifikationsanalytik eingesetzt werden, fehlen derartige Daten für die zugehörigen Abgangsgruppen. Ziel der vorliegenden Dissertation war daher die Identifizierung von Disulfid-Addukten zwischen thiolhaltigen Abgangsgruppen und verschiedenen Plasmakomponenten als neue Klasse von potentiellen Langzeit-Biomarkern. Nach Inkubation von gereinigtem humanem Serumalbumin (HSA) und Plasma mit den V-Typ Nervenkampfstoffen VX, CVX und RVX konnten nach enzymatischer Spaltung mit Pronase CysPro Dipeptide detektiert werden, die mit den zugehörigen Abgangsgruppen über Disulfidbrücken verbunden waren. Der Einsatz von microbore Flüssigchromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie erlaubte dabei die hochselektive und hochsensitive Detektion dieser neuartigen Disulfid-Addukte sowie die simultane Erfassung von bereits etablierten Tyrosin-Addukten. Mithilfe eigens hierfür synthetisierter Peptidstandards konnten zudem MetProCys- und AspIleCys-Tripeptid-Disulfid-Addukte identifiziert werden. Hierdurch wurde gleichzeitig die Fähigkeit der thiolhaltigen Abgangsgruppen zur Öffnung von intramolekularen Disulfidbrücken in Proteinen deutlich. Die Bestimmung der Nachweisgrenzen der V-Stoffe in Plasma anhand international anerkannter Vorgaben der Organisation für das Verbot Chemischer Waffen demonstrierte zudem die Anwendbarkeit der entwickelten Methodik bei toxikologisch relevanten Plasmakonzentrationen. Analog zu den Nervenkampfstoffen konnte die Übertragbarkeit der Bildung von Disulfid-Addukten anhand der beiden Verbindungen Oxydemeton-S-methyl und dessen Hauptmetaboliten Demeton-S-methyl sulfon auf phosphororganische Pestizide gezeigt werden. Abgesehen von HSA-Disulfid-Addukten konnten außerdem Disulfid-Addukte mit freiem Cystein/Cystin erstmalig nachgewiesen werden. Durch Untersuchung von Plasmaproben eines realen Vergiftungsfalls mit Oxydemeton-S-methyl konnte abschließend die Eignung der beschriebenen Disulfid-Addukte als Biomarker zum Nachweis einer Vergiftung mit phosphororganischen Verbindungen belegt werden.Verification of an alleged intoxication with organophosphorus compounds is of great legal, political and toxicological interest but still represents a challenging task for forensic analysis. In order to provide proof of poisoning days or even weeks post-exposure covalent adducts with endogenous proteins are increasingly used as long-term biomarkers. However, unambiguous identification is only feasible if both the phosphyl moiety as well as the leaving group of the respective organophosphorus compound is covered. Whereas adducts between the phosphyl moiety and nucleophilic amino acid residues in endogenous proteins have already been known and are used for verification by default, such data are missing for the corresponding leaving groups. Therefore, the aim of the present thesis was to identify disulfide-adducts between thiol-containing leaving groups and different plasma components as a new class of potential long-term biomarkers. Upon incubation of neat human serum albumin (HSA) and plasma with the V-type nerve agents VX, CVX and RVX followed by enzymatic proteolysis using pronase CysPro dipeptides could be detected that were linked to the corresponding leaving groups via disulfide bridges. Microbore liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry allowed highly selective and sensitive detection of these novel disulfide-adducts together with already established tyrosine-adducts for unambiguous identification of the respective organophosphorus compound. Moreover, MetProCys- and AspIleCys-tripeptide-disulfide-adducts were identified using peptide reference material that was synthesized exclusively for this purpose. Notably, detection of tripeptide-disulfide-adducts clearly showed the ability of thiol-containing leaving groups to open intramolecular disulfide bridges in proteins. Limits of detection for V-type nerve agents in plasma were determined according to the guidelines of the Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons and the applicability of the developed method to toxicologically relevant plasma concentrations was demonstrated. Using the two compounds oxydemeton-S-methyl and its main biotransformation product demeton-S-methyl sulfone it was shown that the formation of disulfide-adducts does not only occur with nerve agents but also with organophosphorus pesticides. Moreover, in addition to HSA-disulfide-adducts it was also possible to detect disulfide-adducts with free cysteine/cystine for the first time. Finally, analyzing plasma samples of a genuine case of intoxication with oxydemeton-S-methyl the suitability of the described disulfide-adducts as biomarkers for verification of an alleged exposure to organophosphorus compounds was demonstrated

A case report of cholinesterase inhibitor poisoning: cholinesterase activities and analytical methods for diagnosis and clinical decision making

Suicidal ingestion of organophosphorus (OP) or carbamate (CM) compounds challenges health care systems worldwide, particularly in Southeast Asia. The diagnosis and treatment of OP or CM poisoning is traditionally based on the clinical appearance of the typical cholinergic toxidrome, e.g. miosis, salivation and bradycardia. Yet, clinical signs might be inconclusive or even misleading. A current case report highlights the importance of enzymatic assays to provide rapid information and support clinicians in diagnosis and rational clinical decision making. Furthermore, the differentiation between OP and CM poisoning seems important, as an oxime therapy will most probably not provide benefit in CM poisoning, but-as every pharmaceutical product-it might result in adverse effects. The early identification of the causing agent and the amount taken up in the body are helpful in planning of the therapeutic regimen including experimental strategies, e.g. the use of human blood products to facilitate scavenging of the toxic agent. Furthermore, the analysis of biotransformation products and antidote levels provides additional insights into the pathophysiology of OP or CM poisoning. In conclusion, cholinesterase activities and modern analytical methods help to provide a more effective treatment and a thorough understanding of individual cases of OP or CM poisoning