Impedimetric array in polymer microfluidic cartridge for low cost point-of-care diagnostics

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Elaboration de nouveaux biocapteurs électrochimiques pour le diagnostic de la thrombose veineuse profonde

La thrombose veineuse profonde (TVP) comme sous le nom de phlébite correspond à la formation d'un caillot sanguin dans une veine. C'est une pathologie fréquente en Europe et elle reste très difficile à diagnostiquer jusqu'à présent. Ce travail qui rentre dans le cadre d'un projet Européen STREP C] consiste à élaborer un biomatériau en tant qu'outil de diagnostic de la thrombose permettant une mesure en temps réel de la présence de la maladie dans le sang du patient. La détection est réalisée par dosage de la glycoprotéine D-Dimère présente lors de la formation d'un thrombus. L'approche qui a été envisagée dans cette étude est celle de l'immobilisation de l'anticorps anti-D-Dimère tagué Histidine sur un matériau polymérique conducteur fonctionnalisé par un complexe métallique. Cette stratégie originale de la construction de l'immunocapteur réalisée étape par étape a permis à la fois d'avoir une fixation orientée de l'anticorps et de suivre la variation du signal électrochimique via le métal utilisé en tant que sonde redox. De ce fait un biocapteur a été développé à base de polypyrrole fonctionnalisé par le complexe métallique Acide NitrilotriacétiquelMétal ionique (NT AJCu2+) et a été intégré par la suite dans un dispositif miniaturisé conçu pour être fiable, précis, portatif, automatisé et économique. L'étude de stabilité dans le temps de ce biomatériau a permis la réalisation d'une nouvelle matrice d'immobilisation de l'anticorps anti-D-Dimère en utilisant un nouveau ligand enPI2 constitué par des groupements amines comms pour une très bonne chélation du cuivre II. La conception du biocapteur sur des nanomatériaux tels que les nanotubes de carbone et les nanoparticules d'or a montré une augmentation de la gamme de détection du D-Dimère. La caractérisation de ces biomatériaux et le suivi du D-Dimère ont nécessité l'utilisation de différentes techniques d'analyses électrochimique et de surface tels que la voltammétrie cyclique (CV), la DPV, la spectroscopie d'impédance électrochimique (SIE), la microscopie à force atomique (AFM), la résonance des plasmons de surface (SPR), L'infrarouge à transformée de Fourrier (FTIR), la spectroscopie des photoélectrons X (XPS) et la résonance magnétique nucléaire (RPE). L'intégration du biocapteur dans la cartouche DVT-IMP comprenant une puce et un corps micro fluidique a permis l'amplification du signal électrochimique notamment de la sonde redox grâce à l'utilisation des élecctrodes interdigitées (EIDs).Deep vein thrombosis (DVT) known as phlebitis corresponds to the formation of a blood clot in a vein. It is a common disorder in Europe and it remains very difficult to diagnose until now. This work within the framework of a European project STREP [] is to develop a biomaterial as a tool for diagnosis of thrombosis allowing real-time measurement of the presence of the disease in the patient's blood. Detection is perfonned by assaying the glycoprotein D-dimer present during the formation of a thrombus. The approach which has been chosen in this study is the immobilization of an Histidine tagged anti-D-Dimer on a conductive polymer material functionalized with a metal complex. This original strategy for the construction of the immunosensor has been achieved step by step allowed both to have an oriented attachment of the antibody and monitor the change in electrochemical signal through the metal used as a redox probe. Thus a biosensor based on polypyrrole functionalized with nitrilotriacetic acid metal complex (NT AJCu2 +) was developed and was subsequently incorporated into a miniaturized device designed to be reliable, accurate, portable, automated and economical. The study of the biomaterial time stability has enabled the creation of a new matrix for the anti-D-dimer immobilization using a new ligand enPI2 containing amine groups known for a very good Copper II chelation. The design of the biosensor on nanomaterials such as carbon nanotubes and gold nanoparticles showed an increase in the D-dimer detection range. The characterization of these biomaterials and the D-dimer monitoring required the use of different electrochemical and surface analytical techniques such as cyclic voltammetry (CV), DifferentiaI Pulse Voltammetry (DPV), the electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the Atomic force microscopy (AFM), the surface plasmon resonance (SPR), The Fourier transform infrared (FTIR), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and nuclear paramagnetic resonance (EPR). The integration of the biosensor in the DVT-IMP cartridge comprising a chip and a microfluidic body allowed the amplification of the electrochemical signal including the redox probe through the use of interdigitated élecctrodes (EIDs).ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Etude et réalisation de biocapteurs impédancemétriques en utilisant différentes approches d'immobilisation

Le but de cette thèse est d'élaborer des biocapteurs impédancemétriques utilisant différents types de matériaux. Nous avons étudié, l'insertion d'anticorps de type IgG dans des monocouches de molécules amphiphiles ODA (octadécylamine) à l'interface air-eau. La couche mixte anticorps/ODA est transférée ensuite sur la surface de l'électrode par la technique de Langmuir-Blodgett. La spectroscopie d'impédance a été utilisée pour suivre l'interaction entre l'anticorps et l'antigène spécifique. Les résultats montrent que cette méthode présente une sensibilité élevée et d'excellentes performances. Nous avons également greffé des oligonucléotides (ODNs) portant un groupe amine sur un film de polypyrrole préalablement fonctionnalisé par un groupement ester activé. La spectroscopie d'impédance a révélé le greffage des ODNs sur le film de polypyrrole ainsi que la réaction d'hybridation avec les ODNs complémentaires. Nous avons montré l'origine des variations des propriétés électriques du film de polypyrrole après une telle interaction. Nous avons utilisé des monocouches auto assemblées (SAMs) pour greffer des molécules en utilisant deux configurations deux configurations de monocouches sur lesquelles nous avons greffé de la biotine hydrazide afin d'étudier l'interaction entre la biotine et l'avidine. Nous avons montré par la spectroscopie d'impédance que la structure chimique de la monocouche influence fortement la sensibilité du biocapteur d'affinité.The goal of this thesis is to design impedancemetric biosensors using various types of materials. We studied, the adsorption of antibody onto the monolayers of amphiphile molecules ODA (octadecylamine) at the air-water interface. The mixed monolayer IgG/ODA was transferred onto a modified SAMs electrode by the technique of Langmuir-Blodgett. The impedance spectroscopy was used to follow the interaction between the antibody and the specific antigen. The results show that this method has a high sensitivity and a quite good characteristics. We had also grafted an oligonucléotides (ODNs) carrying an amino group on a polypyrrole film functionalized by an activated ester. The impedance spectroscopy revealed the grafting of the ODN on film of polypyrrole as well as the reaction of hybridization with the complementary ODNs. We showed the origin of the variations of the electric properties of polypyrrole film after such a reaction. We have also used the self assembled monolayer (SAMs) to graft moleculesusing two SAMs configurations with grafted biotine hydrazide in order to study the interaction between the biotin and an avidin. We showed by impedance spectroscopy that the chemical structure of SAMs influence strongly the sensitivity of the affinity biosensors.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Elaboration de biocapteurs électrochimiques d'ADN à base de métalloporphyrines hydrosolubles et fonctionnalisables

Résumé françaisRésumé anglaisORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Self-Assembled MoS₂/ssDNA Nanostructures for the Capacitive Aptasensing of Acetamiprid Insecticide

The aim of this work is to detect acetamiprid using electrochemical capacitance spectroscopy, which is widely used as a pesticide in agriculture and is harmful to humans. We have designed aptasensing platform based on the adsorption of a DNA aptamer on lipoic acid-modified MoS2 nano-sheets. The biosensor takes advantage of the high affinity of single-stranded DNA sequences to MoS2 nano-sheets. The stability of DNA on MoS2 nano-sheets is assured by covalent attachment to lipoic acid that forms self-assembled layer on MoS2 surface. The biosensor exhibits excellent capacitance performances owing to its large effective surface area making it interesting material for capacitive transduction system. The impedance-derived capacitance varies with the increasing concentrations of acetamiprid that can be attributed to the aptamer desorption from the MoS2 nanosheets facilitating ion diffusion into MoS2 interlayers. The developed device showed high analytical performances for acetamiprid detection on electrochemical impedance spectroscopy EIS- derived capacitance variation and high selectivity toward the target in presence of other pesticides. Real sample analysis of food stuff such as tomatoes is demonstrated which open the way to their use for monitoring of food contaminants by tailoring the aptamer

Electrochemical detection of the human cancer biomarker ‘autocrine motility factor-phosphoglucose isomerase’ based on a biosensor formed with a monosaccharidic inhibitor

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Purification et caractérisation d'une nouvelle peroxydase extraite de l'ail et son application en tant que biocapteur électrochimique pour l'analyse alimentaire et environnementale

La nouvelle peroxydase (POX1B) extraite de l'Ail possède des propriétés biochimiques intéressantes par comparaison à HRP. En effet, elle est hautement active à pH acide et stable vis-à-vis de la température et de la conservation. Elle présente un pH optimum d'environ 5 et une température optimale de 30C. L'enzyme conserve 70 % de son activité initiale à 60C et une activité totale à 50 et 40C après 40 min. Par la suite, l'étude de la relation structure-fonction a été réalisée en analysant les propriétés spectroscopiques ainsi que leur corrélation à la structure déterminée par une nouvelle génération de spectromètre de masse hybride à haute performance. Les études de la structure chimique ont montré que le groupement héminique de cette protéine est pentacoordiné et renferme une histidine comme ligand proximal. POX1B sous-forme native et reconstituée a montré une haute affinité vis-à-vis du peroxyde d'hydrogène ainsi que vis-à-vis d'une variété de co-substrats réducteurs. En plus, une haute spécificité de l'enzyme a été démontrée. Les valeurs de kcat/KM sont 413.28, 403.81 mM-1s-1 respectivement pour le TMB et l'ABTS. Par ailleurs, la réduction des composés nitrés en présence de POX1B a été démontrée par la formation de complexes Fe(II)-nitrosoalcanes. POX1B présente un grand potentiel d'application pour le métabolisme des médicaments puisqu'elle est capable de réagir avec le 1-nitrohexane en présence du dithionite de sodium comme ça a été démontré par l'apparition d'une bande de Soret caractéristique à 411 nm. En plus, l'efficacité catalytique de la nouvelle peroxydase extraite de l'Ail pourrait être exploitée pour la détection d'une variété d'analytes et en biocatalyse. L'enzyme possède un bon potentiel d'application en tant que biorécepteur pour la détection électrochimique du peroxyde d'hydrogène et des polluants. L'immobilisation de l'enzyme a été réalisée en utilisant le chitosane comme biopolymère. Les essais électrochimiques ont montré que le biocapteur est capable de mesurer une concentration de H2O2 allant jusqu'à 100 nM en mode de détection directe. La limite de détection mesurée dans des échantillons de lait a été de 30 M avec un temps de réponse inférieur à 1 min. Par la suite, l'activité électro-catalytique d'un second biocapteur à base de POX1B a été démontrée en présence de dérivés de chlorophénols avec des concentrations variant entre 10 pM et 10 M. Le biocapteur construit avec POX1B et sans utilisation d'un médiateur a présenté une bonne sensibilité en présence du 2,6-dichlorophénol, du 4-chlorophénol et du pentachlorophénol. Une limite de détection de l'ordre de 1 pM a été mesurée dans le cas du 4-chlorophénol avec une constante cinétique Km,app de 0.42 M et un temps de réponse électrochimique rapide de l'ordre d'1 s.A new peroxidase was purified from garlic bulbs (POX1B) with interesting biochemical properties compared to HRP. ln fact, POX1B is highly active at acidic pH and stable vs. temperature and storage. The optimal pH was around 5 and the optimal temperature was 30C. Studies of the heat-stability demonstrated that almost 70 % of the initial activity was conserved at 60C and full activity was retained at 50 and 40C for 40 min. Then, the structure-function relationship was investigated by analysis of the spectroscopic properties and correlated to the structure determined by a new generation of high performance hybrid mass spectrometer. Studies of the chemical structure showed that the heme group of this protein is pentacoordinated and has a histidine as proximal ligand. Native and reconstituted POX1B exhibited high affinity towards hydrogen peroxide as well as various reducing co-substrates. ln addition, high enzym specificity was demonstrated. The kcat/KM values were 413.28, 403.81 mM-1s-1 for TMB and ABTS, respectively. Furthermore, the reduction of nitro compounds in presence of POX1B was demonstrated by iron(II)-nitrosoalkane complexes assay. POX1B showed a great potential to be a lied for drug metabolism since its ability to react with 1-nitrohexane in resence of sodium dithionite was demonstrated by the appearance of a characteristic Soret band at 411 nm. Besides, the high catalytic efficiency obtained in the case of the new garlic peroxidase (POX1B is suitable for different analytes monitoring and biocatalysis). The enzyme has shown a good potential for electrochemical detection of hydrogen peroxide and chlorophenols. The enzyme immobilization was carried out using chitosan as biopolymer. Electrochemical assays showed that the biosensor was able to monitor H2O2 as low as 100 nM in direct detection mode. The measured detection limit was 30 M in milk samples with a response time less than 1 min. Then, the electrocatalytic activity of a second POX1B-based biosensor towards chlorophenols derivatives in a large range from 10 pM to 10 M was demonstrated. The mediator free POX1B based biosensor exhibited high sensitivity towards 2,6-dichlorophenol, 4-chlorophenol and pentachlorophenol. A detection limit of 1 pM in the case of 4-chlorophenol was demonstrated with kinetic constant Km,app of 0.42 M and high rapidity of electrochemical response of the biosensor of 1 s.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

E-DNA detection of rpoB gene resistance in Mycobacterium tuberculosis in real samples using Fe3O4/polypyrrole nanocomposite

International audienceIn this work, we achieved the selective detection of wild and mutated rpoB gene in M. tuberculosis using an electrochemical DNA (E-DNA) sensor based on polypyrrole/Fe3O4 nanocomposite bearing redox naphthoquinone tag on PAMAM (spaNQ/PAMAM/PPy/Fe3O4). The hybridization between a given probe and the complementary DNA target induced a large decrease in the naphthoquinone redox signal as measured by SWV and no cross-hybridization with single nucleotide mismatch DNA target occurred. Thanks to the catalytic properties of iron oxide nanoparticles combined with conducting properties of polypyrrole platform, we demonstrated that the transducing system allowed the detection of 1 fM of DNA target in a 50-µL drop corresponding to 3 × 104 copies of DNA. The sensor was able to detect the rpoB gene in PCR-amplified samples of genomic DNA and could also discriminate between the wild type rpoB gene and a single nucleotide mutated rpoB gene that provides resistance to rifampicin. Furthermore, the sensor could selectively detect the wild and mutant DNA in genomic samples without PCR amplification

π-Conjugated Polymer Nanoparticles from Design, Synthesis to Biomedical Applications: Sensing, Imaging, and Therapy

International audienceIn the past decade, π-conjugated polymer nanoparticles (CPNs) have been considered as promising nanomaterials for biomedical applications, and are widely used as probe materials for bioimaging and drug delivery. Due to their distinctive photophysical and physicochemical characteristics, good compatibility, and ease of functionalization, CPNs are gaining popularity and being used in more and more cutting-edge biomedical sectors. Common synthetic techniques can be used to synthesize CPNs with adjustable particle size and dispersion. More importantly, the recent development of CPNs for sensing and imaging applications has rendered them as a promising device for use in healthcare. This review provides a synopsis of the preparation and functionalization of CPNs and summarizes the recent advancements of CPNs for biomedical applications. In particular, we discuss their major role in bioimaging, therapeutics, fluorescence, and electrochemical sensing. As a conclusion, we highlight the challenges and future perspectives of biomedical applications of CPNs