Az érfal trombogenitása és hatása a trombolizisre = Thrombogenicity of the vascular wall and its impact on thrombolysis

A projekt keretében az érfal – vérsejt interakciók a trombus keletkezésében betöltött szerepét és az így alakuló véralvadék litikus érzékenységét vizsgáltuk. Fő megállapításaink: 1. Leukocita eredetű proteázok (elasztáz, matrix metalloproteáz 8 és 9) úgy módosítják az érfal szerkezetét, hogy a vérlemezkék von Willebrand faktor (VWF)-függő adhéziója fokozódik. 2. A VWF jelenléte kivédi a fibrinogén plazminnal történő proteolízisét, így hozzájárul a vérlemezkék közötti fibrinogén hidak fenntartásához. 3. Sebészileg eltávolított trombusok hisztológiai feldolgozása igazolja a leukociták in vivo szerepét a trombusok feloldásában valamint a sejt-eredetű foszfolipidek és szabad zsírsavak trombuson belüli jelenlétét. 4. A zsírsavak növelik a szöveti plazminogén aktivátor (tPA) fibrin-specificitását azáltal, hogy fokozzák a plazminogén aktivációt fibrin felszínen, de gátolják azt homogén oldatban. 5. A zsírsavak gátolják a keletkező plazmint is kevert-típusú inhibitorként, míg a fibrin részben kivédi ezt a gátlóhatást. 6. Vérplazma eredetű immunoglobulin G módosítja a lipidek fibrinolízisre gyakorolt hatásait, méghozzá eltérő módon egészségeseknél és egyes kóros állapotokban. 7. Modell rendszerben az intermolekuláris béta-lemezek fokozzák a tPA-függő plazminogén aktivációt és emellett ilyen szerkezetek átmeneti megjelenése kimutatható a fibrinháló oldása során. Eredményeink alapul szolgálhatnak a trombusszerkezethez igazított trombolitikus eszközök tervezéséhez és fejlesztéséhez. | The research targeted the role of the interactions of the blood vessel wall and blood cells in the formation of thrombi, as well as the lytic susceptibility of the formed thrombi. Major results: 1. Leukocyte-derived proteases modify the structure of the arterial wall, so that the von Willebrand factor (VWF) dependent adhesion of platelets increases. 2. The presence of VWF protects fibrinogen against digestion with plasmin and thus contributes to the stability of the fibrinogen as adhesive glue between platelets. 3. Histological evidence from thrombi removed with surgery supports the in vivo role of leukocytes in the dissolution of thrombi as well as the presence of phospholipids and free fatty acids (FFA) in thrombi. 4. FFA increase the fibrin specificity of tissue plasminogen activator (tPA) through stimulation of plasminogen activation on fibrin surface and inhibition of tPA in solution. 5. FFA inhibit the generated plasmin in a mixed-type inhibitor pattern and fibrin protects plasmin against this inhibition. 6. Blood-derived immunoglobulin G modifies the lipid effects on fibrinolysis in a manner, which differs in healthy subjects and antiphospholipid syndrome patients. 7. In a model system intermolecular beta-sheets stimulate the tPA-dependent plasminogen activation and the presence of such structures can be shown transiently in the course of fibrin dissolution. Our results can be implemented in the design of thrombolytic tools tailored to specific thrombus structures

Trombolízis: a trombus celluláris és molekuláris komponenseinek hatása a fibrinolízisre = Thrombolysis: modulation of fibrinolysis by cellular and molecular components of thrombi

Megvizsgáltuk, hogy egy trombusban lévő komponensek hogyan befolyásolják a fibrin szerkezetét, annak feloldását illetve a fibrinolízis iniciálásában szerepet játszó enzimeket. A vörösvértestek különböző eloszlásban találhatók és litikus rezisztenciát okozhatnak. Módosíthatják a fibrin strukturát és gátolják a plazminogén aktivációt. A vörösvértestek különböző eloszlása magyarázhatja a betegek eltérő reakcióit a fibrinolítikus terápia során. Más kísérletek azt jelzik, hogy a fibrin feloldását hátráltathatja a mechanikai stress azáltal, hogy a fibrin feszülése gátlólak hat a plazminogén aktivációra. Ami a neutrofil granulocitákat illeti azt találtuk, hogy az arteriás human trombus feloldásában a leukocita elasztáz jelentős szerepet játszhat és az függ a vérlemezkétől is, mert azok hasonlóan a plazmin függő lízishez, stabilizálhatják a trombust a sejt-függő fibrinolízisben is. A vérlemezke adhéziója az érfal mediájához egy nagyságrenddel nagyobb lesz, ha az ér falát neutrofil elasztázzal vagy matrix metalloproteinázzal kezeljük. Az érfalban történő morfológiai változásokat atomerő mikroszkóppal és scanning elektron mikroszkóppal mutattuk ki. A vonWillebrand faktorral kimutattuk, hogy bár a plazminnak lehet gyenge szubsztrátja (a fibrinogénhez képest) mégis megvédi a fibrinogént a plazmin emésztésétől, a fibrinogén alvadóképes marad és adhezív képességét is megtartja a vérlemezke gazdag trombusban . | We examined components the present in a thrombus how influence the fibrinolysis? We found that red blood cells are distributed is different ways, in a thrombus and may cause lytic resistance. The various distribution of red blood cells may explain the different reactions of patients during fibrinolytic therapy. Other experiment indicate that the mechanical stress hinders fibrin dissolution because fibrin stretch inhibits plasminogen activation. For this publication already appeared commentary reference We further examined these possibilities. We found that in the solubilization of arterial human thrombus the leukocyte elastase may play a significant role and this depends on platelets too because they stabilize the thrombus . Adhesion of platelet to the media of vessel wall increases by an order of magnitude if the vessel wall is treated by neutrophyl elastase or matrix metalloproteinase. The morphological change in the vessel wall was followed by atomic force microscopy and scanning electron microscopy. We showed about von Willebrand factor, that it may be a week substrate of plasmin (compared with fibrinogen), nevertheless it protects fibrinogen from digestion by plasmin, the clotting and the adhesive capacity of fibrinogen remains in the platelet rich thrombus . We also studied that components released by proteases from arterial plaque how influence fibrinolysis.

A trombolízis endogén modulációja = Endogenous modulations of thrombolysis

Az eredmények két feltételezés köré csoportosulnak. Az egyik, hogy a fibrinolítikus reakciók kompartmentekben játszódnak le, szilárd és folyékony fázis határfelületén, ahol a reakciósebességek nagy mértékben megváltoznak. Ilyen kompartmentnek tekinthető maga a trombus is. A másik hipotézis, hogy egy trombusban a fibrinen és vérlemezkén kívül egyéb molekuláris és celluláris komponensek is találhatók, amelyek megváltoztathatják a fibrin szerkezetét és fibrinolítikus reakciók sebességét. Az eredményeink azt jelzik, hogy a miozinen kívül (amely vérlemezkéből származhat) a vérlemezke foszfolipidek és az ezekből felszabaduló zsírsavak is befolyásolhatják a fibrinolízist. A foszfolipidek általában gátolják a plazminogén aktivációját és a plazmin aktivitását. Ezen kívül a trombusban diffúziós barriert képeznek az aktivátorokkal szemben. A zsírsavak is hasonlóan viselkednek, kivéve azt, hogy fibrin felszínen a plazminogén aktivációját fokozzák (fibrin specifikus zsírsav hatás). A trombusban immunglobulinok (IgG) is találhatók, amelyek szintén gátolják a fibrinolízist. Ez a gátló hatás, antifoszfolipid szindrómás betegből izolált IgG jelenlétében sokkal kifejezettebb. Kimutattuk, hogy bizonyos denaturált fehérjék (hasonlóan a fibrinhez) tPA kofaktorként viselkednek, amiért az aggregátum mérete (10 nm rádiusz felettinek kell, hogy legyen) és a béte-redőzet mennyisége a felelős. | The results are assembled around two groups. One is that the fibrinolytic reactions occur in compartments, on the surface of solid and fluid phase, where the reaction rates are extremely changed. Such a compartment is a thrombus itself. The other hypothesis is that in a thrombus besides fibrin and platelet there are additional molecular and cellular components which may alter the structure of fibrin and the rate of fibrinolytic reactions. Our results indicate that besides myosin (originated from platelets), platelet phospholipids and fatty acids released from them may influence fibrinolysis. The phospholipids, usually inhibit the activation of plasminogen and the activity of plasmin. In addition, they form diffusion barrier against the plasminogen activators. Fatty acids act similarly, except that on the surface of fibrin they accelerate plasminogen activation. Immunoglobulins (IgG) also can be found in a thrombus and they inhibit fibrinolysis, this inhibition is more expressed when IgG is isolated from patients with antiphospholipid-syndrome. We proved that certain denatured proteins (similarly to fibrin) act as cofactor for tPA, and for this nature the size of aggregatum (>10nm) and the amount of beta-sheet are responsible

Structure and Function of Trypsin-Loaded Fibrinolytic Liposomes

Protease encapsulation and its targeted release in thrombi may contribute to the reduction of haemorrhagic complications of thrombolysis. We aimed to prepare sterically stabilized trypsin-loaded liposomes () and characterize their structure and fibrinolytic efficiency. Hydrogenated soybean phosphatidylcholine-based were prepared and their structure was studied by transmission electron microscopy combined with freeze fracture (FF-TEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), and small-angle X-ray scattering (SAXS). Fibrinolytic activity was examined at 45, 37, or 24°C on fibrin or plasma clots with turbidimetric and permeation-driven lysis assays. Trypsin was shown to be attached to the inner surface of vesicles (SAXS and FF-TEM) close to the lipid hydrophilic/hydrophobic interface (FT-IR). The thermosensitivity of was evidenced by enhanced fibrinolysis at 45°C: time to reduce the maximal turbidity to 20% decreased by 8.6% compared to 37°C and fibrin degradation product concentration in the permeation lysis assay was 2-fold to 5-fold higher than that at 24°C. exerted its fibrinolytic action on fibrin clots under both static and dynamic conditions, whereas plasma clot dissolution was observed only in the permeation-driven assay. The improved fibrinolytic efficiency of under dynamic conditions suggests that they may serve as a novel therapeutic candidate for dissolution of intravascular thrombi, which are typically exposed to permeation forces

Neutralization of the anti-coagulant effects of heparin by histones in blood plasma and purified systems

SummaryNeutrophil extracellular traps (NETs) composed primarily of DNA and histones are a link between infection, inflammation and coagulation. NETs promote coagulation and approaches to destabilise NETs have been explored to reduce thrombosis and treat sepsis. Heparinoids bind histones and we report quantitative studies in plasma and purified systems to better understand physiological consequences. Unfractionated heparin (UFH) was investigated by activated partial thromboplastin time (APTT) and alongside low-molecular-weight heparins (LMWH) in purified systems with thrombin or factor Xa (FXa) and antithrombin (AT) to measure the sensitivity of UFH or LMWH to histones. A method was developed to assess the effectiveness of DNA and non-anticoagulant heparinoids as anti-histones. Histones effectively neutralised UFH, the IC50 value for neutralisation of 0.2 IU/ml UFH was 1.8 μg/ml histones in APTT and 4.6 μg/ml against 0.6 IU/ml UFH in a purified system. Histones also inhibited the activities of LMWHs with thrombin (IC50 6.1 and 11.0 μg/ml histones, for different LMWHs) or FXa (IC50 7.8 and 7.0 μg/ml histones). Direct interactions of UFH and LMWH with DNA and histones were explored by surface plasmon resonance, while rheology studies showed complex effects of histones, UFH and LMWH on clot resilience. A conclusion from these studies is that anticoagulation by UFH and LMWH will be compromised by high affinity binding to circulating histones even in the presence of DNA. A complete understanding of the effects of histones, DNA and heparins on the haemostatic system must include an appreciation of direct effects on fibrin and clot structure.</jats:p