Rapid single step subcloning procedure by combined action of type II and type IIs endonucleases with ligase

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The subcloning of a DNA fragment from an entry vector into a destination vector is a routinely performed task in molecular biology labs.</p> <p>Results</p> <p>We here present a novel benchtop procedure to achieve rapid recombination into any destination vector of choice with the sole requirement of an endonuclease recognition site. The method relies on a specifically designed entry vector and the combined action of type II and type IIs endonucleases with ligase. The formulation leads to accumulation of a single stable cloning product representing the desired insert carrying destination vector.</p> <p>Conclusion</p> <p>The described method provides a fast single step procedure for routine subcloning from an entry vector into a series of destination vectors with the same restriction enzyme recognition site.</p

Molecular and Neuroendocrine Determinants of Seasonal Body Weight Regulation

This thesis deals with the characterisation of neuroendocrine pathways involved in seasonal body regulation revealed by the Siberian hamster (Phodopus sungorus). In the neuronal centre of body weight regulation, the hypothalamus, central signal transduction of the "adiposity signals" leptin and insulin (both inhibit food intake) and of the food intake stimulating hormone ghrelin was investigated comprehensively. Another aim of this thesis was the identification of the molecular identity underlying the phenomenon of leptin resistance, a key event in the onset of obesity. Furthermore, possible convergence of central leptin- and insulin signalling pathways was investigated. The hypothalamic signal transduction of both hormones was strikingly seasonally regulated implying a central role of these humoral signals in mediating seasonal body weight changes. The molecular identity of seasonally induced leptin resistance could be unravelled: It is caused by modulation of the signal transduction cascade distal to the leptin receptor. Moreover, the results of this thesis contradict to the popular opinion of possible synergistic effects conveyed by the anorexigenic hormones leptin and insulin which are related to their hypothalamic signalling. Ghrelin and its central signalling by the ghrelin receptor is very likely responsible for the acute regulation of food intake whereas it does not act on chronic changes in energy homeostasis (seasonal body weight cycles)

Functional characterization of UCP1 in mammalian HEK293 cells excludes mitochondrial uncoupling artefacts and reveals no contribution to basal proton leak

AbstractMechanistic studies on uncoupling proteins (UCPs) not only are important to identify their cellular function but also are pivotal to identify potential drug targets to manipulate mitochondrial energy transduction. So far, functional and comparative studies of uncoupling proteins in their native environment are hampered by different mitochondrial, cellular and genetic backgrounds. Artificial systems such as yeast ectopically expressing UCPs or liposomes with reconstituted UCPs were employed to address crucial mechanistic questions but these systems also produced inconsistencies with results from native mitochondria. We here introduce a novel mammalian cell culture system (Human Embryonic Kidney 293 — HEK293) to study UCP1 function. Stably transfected HEK293 cell lines were derived that contain mouse UCP1 at concentrations comparable to tissue mitochondria. In this cell-based test system UCP1 displays native functional behaviour as it can be activated with fatty acids (palmitate) and inhibited with purine nucleotides guanosine-diphosphate (GDP). The catalytic centre activity of the UCP1 homodimer in HEK293 is comparable to activities in brown adipose tissue supporting functionality of UCP1. Importantly, at higher protein levels than in yeast mitochondria, UCP1 in HEK293 cell mitochondria is fully inhibitable and does not contribute to basal proton conductance, thereby emphasizing the requirement of UCP1 activation for therapeutic purposes. These findings and resulting analysis on UCP1 characteristics demonstrate that the mammalian HEK293 cell system is suitable for mechanistic and comparative functional studies on UCPs and provides a non-confounding mitochondrial, cellular and genetic background

Funktionsanalyse der mitochondrialen Transportproteine UCP2, UCP3, UCPx und SOUP

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Funktion der mitochondrialen Transportproteine UCP2, UCP3 und UCPx als Protonentransporter bzw. Entkopplerproteine untersucht. Für diese Analysen wurde ein Testsystem etabliert, mit dem ein möglicher Einfluss der Entkopplerproteine auf die Atmung von HEK293-Zellen nach transienter Expression nachgewiesen werden konnte. Da UCP1 das bislang einzige funktionell charakterisierte Mitglied der Entkopplerproteinfamilie ist, wurde das Messverfahren zunächst mit UCP1 transfizierten HEK293-Zellen validiert. Die Expression und Inkorporation von UCP1 und UCP3 in die Mitochondrien von HEK293-Zellen wurde mittels Western-Blots bestätigt. Die Sauerstoffverbrauchsmessungen haben gezeigt, dass die UCP1 transfizierte Zellen nach Inhibition der ATP-Synthase durch Oligomycin eine geringere Kopplung der Atmung zeigten, als die Kontrollzellen. Nach Palmitatzugabe erhöhte sich die Atmungsrate der UCP1-Zellen signifikant. Diese fettsäureabhängige Aktivierung bestätigte die Expression von funktionsfähigem UCP1. Bei den Kontrollen erfolgte keine Steigerung der Atmung nach Fettsäurezugabe. Zellen die mit UCP2, UCP3 und UCPx transfizierten wurden, zeigten weder eine erhöhte entkoppelte Atmung in Anwesenheit von Oligomycin, noch eine durch Fettsäuren induzierte Entkopplung der Atmung. Eine mit UCP1 vergleichbare Entkopplerfunktion von UCP2, UCP3 und UCPx konnte damit nicht bestätigt werden. Des Weiteren wurde ein vermuteter regulatorischer bzw. inhibitorischer Einfluss des mitochondrialen Folat-Carriers SOUP auf die UCP vermittelte Entkopplung, nach Koexpression mit UCPx und UCP1 in HEK293-Zellen geprüft. Die Koexpression von SOUP mit UCPx oder UCP1 hatte allerdings keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung der Zellen bzw. auf die UCP1 vermittelte Entkopplung. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die mögliche Bedeutung von UCP3 als Regulator des mitochondrialen Fettsäurestoffwechsels in Dsungarischen Zwerghamstern untersucht, die aufgrund einer bislang unbekannten Mutation ein gewebespezifisches UCP3 Defizit im braunen Fettgewebe besitzen. Für die Analyse wurden Wildtyphamster und Mutanten sieben Tage kälteexponiert, 48 h gefastet oder unter Kontrollbedingungen bei 23°C mit ad libitum Futter gehalten. Von Wildtypen und Mutanten wurde die Genexpression von UCP3, sowie von Schlüsselenzymen des Fettsäurestoffwechsels analysiert, um Hinweise auf eine mögliche Störung des Fettsäurestoffwechsels bei den Mutanten zu erhalten. Analysiert wurde die mRNA-Expression der mitochondrialen Thioesterase-I (MTE-I) und der Carnitin-Palmitoyltransferase-I (CPT-I). Im braunen Fettgewebe von Mutanten konnte weder die UCP3 mRNA, noch das UCP3-Protein mittels Northern bzw Western Blots nachgewiesen werden. Im braunen Fettgewebe von Wildtypen waren keine Unterschiede im mRNA-Spiegel zwischen Kontrollen, gefasteten und kaltakklimatisierten Hamstern feststellbar. Der Proteingehalt bei kälteexponierten Wildtyptieren war allerdings 3-fach höher und bei den gefasteten Tieren tendenziell erniedrigt gegenüber den Kontrollen. Die Analyse mRNA-Expression der MTE-I in Wildtyphamstern und Mutanten hat gezeigt, dass offenbar keine gekoppelte Regulation der Expression der MTE-I und UCP3 im braunen Fettgewebe erfolgt, womit offensichtlich keine direkte funktionelle Kopplung zwischen beiden Proteinen besteht. Es konnte jedoch feststellt werden, dass die Regulation von UCP3 und der MTE-I offenbar abhängig vom Fettsäurestoffwechsel im Gewebe erfolgt. Die mRNA-Expression der CPT-I mRNA im braunen Fettgewebe der Wildtypen und Mutanten war vergleichbar. Demzufolge gab es keine Anzeichen für eine veränderte Regulation oder eine Inhibition des Fettsäureimports in die Mitochondrien der Mutanten. Die Fettsäureoxidationskapazität des braunen Fettgewebes von gefasteten, kaltakklimatisierten und Kontroll-Wildtyphamstern und Mutanten wurde in Gewebeproben in vitro anhand der CO2-Produktion mit Oleat als Substrat ermittelt. Zudem wurde die Fettsäureoxidationskapazität von isolierten Braunfettmitochondrien aus kälteexponierten Wildtyphamstern und Mutanten durch Messung des O2-Verbrauchs in Anwesenheit von Palmitoyl-Carnitin als Substrat bestimmt. Diese Messungen haben ergeben, dass die mitochondriale Fettsäureoxidationskapazität des braunen Fettgewebes offensichtlich nicht durch das Fehlen von UCP3 beeinträchtigt wird. Auch die Messung des Fettsäurestoffwechsels in isolierten Mitochondrien von Wildtypen und Mutanten hat keine eindeutigen Hinweise auf eine Störung der mitochondrialen beta-Oxidation durch das UCP3 Defizit ergeben. Zusammenfassend kann man sagen, dass anhand der in dieser Arbeit durchgeführten Genexpressionsstudien und in vitro Messungen des Fettsäurestoffwechsels, kein direkter funktioneller Zusammenhang oder ein regulativer Einfluss von UCP3 auf den Fettsäurestoffwechsel bestätigt werden kann

Hypothalamic gene expression profiling in mouse strains susceptible or resistant to diet-induced obesity

Fettleibigkeit hat sich zu einem weltweiten Gesundheitsproblem in der Öffentlichkeit entwickelt. Sie wird durch ein komplexes Ungleichgewicht der Regulation von Appetit und Energiestoffwechsel verursacht, die durch verschiedene Faktoren wie genetische Defekte, Nahrungspräferenzen und Lebensstil kontrolliert werden. Die hochfetthaltige westliche Nahrung ist einer Hauptfaktor, die die Entwicklung von Fettleibigkeit in der menschlichen Bevölkerung fördert. Trotzdem werden nicht alle Konsumenten der Hochfettnahrung fettleibig. In dieser Studie wurden zwei unterschiedliche Mausinzuchtlinien – AKR/J und SWR/J – entweder mit einer hoch fetthaltigen Nahrung oder der Standardnahrung gefüttert. Der AKR/J Stamm repräsentiert ein Mausmodel für diät-induzierte Fettleibigkeit (diet-induced obesity = DIO). Mäuse dieses Stammes wurden fett wenn sie mit der hochfetthaltigen Diät gefüttert wurden, wohingegen sie schlank bei Fütterung mit der Standard-Diät blieben. Im Gegensatz dazu waren die Mäuse des SWR/J Stamm resistent gegenüber der DIO, d.h. es war im Vergleich kein wahrnehmbar Anstieg des Körpergewichts oder von Fettleibigkeit in Mäusen, die mit fetthaltiger Nahrung oder Standard-Diät gefüttert wurden. Genexpressions-Arrays wurden benutzt um differentiell exprimierte Gene im Hypothalamus von AKR/J und SWR/J Mäusen bei fetthaltiger Fütterung zu identifizieren. Um die Kandidatengene, ausgesucht aus der Array Datenanalyse to validieren, wurde Northern Blot Analyse, in situ Hybridisierung und real-time RT-PCR durchgeführt. Hämoglobin alpha, adult chain 1 (Hba-alpha1) ist auf dem Chromosom 11 der Maus (Chromosom 16p13.3 des Menschen) lokalisiert. Die funktionelle Bedeutung der Expression von Hba-alpha1 ist unbekannt. Eventuell erleichtert es den Sauerstofftransport im Gehirn in einer ähnlichen Weise wie das Myoglobin im Skelettmuskel. In dieser Arbeit wurde eine höhere ubiquitäre Expression von Hba-alpha1 im Hirn der SWR/J Maus im Vergleich zur AKR/J Maus beobachtet. Dieser Unterschied könnte mit der höheren Stoffwechselrate der SWR/J Mäuse zusammenhängen. So weit konnte keine direkte Beziehung zwischen Hba-alpha1 Expression und Fettleibigkeit hergestellt werden. Im Gegensatz dazu zeigt die Glyoxalase I (Glo 1) ein spezifisches Expressionsmuster mit stärkster Präsenz im Hippocampus. Im Hypothalamus kann die Glo1 Expression im arquatischen Nukleus (ARC), im ventromedialen hypothalamischen Nukleus (VMH) und im paraventricularen hypothalamischen Nukleus (PVN) detektiert werden. Während die Expression von Glo1 ausserhalb des Hypothalamus ähnlich in beiden Mausstämmen ist, ist die mRNA Expression in der hypothalamischen Region viel stärker in AKR/J im Vergleich zur SWR/J Mäusen. Das Glo1 Gen befindet sich auf Chromosom 17 der Maus (Chr. 6 des Menschen) und an der Entgiftung von Stoffwechselnebenprodukten beteiligt. Außerdem wurde Glo1 auf der Fettleibigkeits-Genkarte vom Menschen verzeichnet und vermutet eine Verbindung zwischen einer abweichenden Expression des Glyoxalase-Systems und Krankheiten wie Krebs und Diabetes. Tumor Nekrose Faktor alpha-induziertes Protein 1 (endothelial) (tumor necrosis factor alpha induced protein 1 (TNFAIP1) ist auf Maus-Chromosom 11(45,10 cM) und Mensch-Chromosom 17q22-q23 lokalisiert. Das Protein ist beim Kalium-Eisen-Transport durch Proteinbindung und bei der Einstellung der spannungsabhängigen Kaliumkanal Aktivitäten involviert. TNFAIP1 lokalisiert sich im ARC, im VMH und PVN. Es wurde durch Hochfett-Diäten in den AKR/J aber nicht SWR/J Mäusen hochreguliert, was an den Filterarrays und den Northern Blots, aber nicht mit der real-time RT-PCR und in situ Hybridisierungen gezeigt werden konnte. Obwohl bei der in situ Hybridisierung eine 1,6fache Steigerung der mRNA Expression im ARC und VMH durch die Hochfettdiät beobachtet werden konnte, war diese Steigerung aufgrund individueller Variationen nicht signifikant. Weitere Experimente mit höherer Stichprobenzahl müssten durchgeführt werden um dieses Ergebnis zu bestätigen. Weil es sich um ein neu annotiertes Gen handelt, ist nicht viel über die pathologische Relevanz bekannt. Bisher hat keine Studie eine Verbindung zwischen TNFAIP1 und Fettleibigkeit beschrieben. Es wird angenommen, dass TNFalpha einen Einfluss auf Körpergewichtsregulation hat und wahrscheinlich durch einen lokalen Prozess im Fettgewebe wirkt. Möglicherweise führt eine erhöhte Sekretion von TNFalpha aus Adipozyten in fettleibigen Versuchstieren/-personen zu einer Induktion von TNFAIP1 im Hypothalamus. Weitere Studien sollten durchgeführt werden um die Funktion von TNFAIP1 im Gehirn aufzuklären

Identification and characterization of neuroendocrine pathways involved in the regulation of seasonal body weight cycles

Die vorliegende Dissertation beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung von neuroendokrinen Signalwegen, die in die saisonale Körpergewichtsregulation involviert sind. Die vorliegenden Untersuchungen liefern neue Befunde über die Bedeutung des zentralen hypothalamischen Signalweges, der die Interaktion von Photoperiode und Leptin auf die saisonale Anpassung des Dsungarischen Hamsters vermittelt. Die erste Studie (Kapitel 2) konzentriert sich auf die Verteilung und Charakterisierung von ausgewählten Neuropeptiden (CART, MCH, OXB), die in der Regulation der Energiebalance eine Rolle spielen. Es scheint eine neuroanatomische Grundlage für ein neuronales CART-MCH-OXB System zu geben, das indirekt die Erzeugung der ciradianen Rhythmik beeinflusst. Die zweite Studie (Kapitel 3) beschäftigte sich mit einer möglichen Interaktion zwischen den neuropeptidhaltigen Neuronen (OXB) und dem Hauptsignalweg, dem geniculohypothalamischen Tractus. Dieser Hauptsignalweg gesteht aus NPY-enthaltenen Neuronen im IGL. OXB-ir Fasern innervieren dort die NPY Neuronen. Dies deutet auf die Existenz eines Rückkopplungsmechanismus von Neuropeptiden auf das circadiane Zeitgebersystem hin. In Kaptitel IV wurde der Effekt der saisonalen Anpassung auf die Expression von CART untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie offenbarten eine erhöhte Anzahl von CART ir Zellen innerhalb des rostralen und ventromedialen ARC. Diese Region spielt bei Tierarten wie Ratte und Maus eine wichtige Rolle bei der Vermittlung eines inhibitorischen Effektes von Leptin auf die Nahrungsaufnahme. Deshalb haben wir uns im Kapitel V auf die Identifizierung der hypothalamischen Strukturen konzentriert, die den Effekt von Leptin im Dsungarischen Hamster vermitteln. Diese Studie ergab, dass Leptin die zelluläre Antwort (Induktion von fos) in mehreren hypothalmischen Strukturen induziert. Hierzu gehören auch die Strukturen der rostralen und ventrolateralen Region des ARC (peri-ARC). Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin, dass der ARC als zentrales anatomisches Integrationszentrum für Körperfett und photoperiodische Information, die Energiebilanz im Dsungarischen Hamster reguliert. Der Schlussteil der Arbeit umfasst eine generelle Disksussion der Ergebnisse und einen Ausblick auf zukünftige mögliche Studien

Test Systems to Study the Structure and Function of Uncoupling Protein 1: A Critical Overview

The discovery of active brown adipose tissue (BAT) in healthy adult humans has renewed interest in the biology of this organ. BAT is capable of distributing nutrient energy in the form of heat allowing small mammals to efficiently defend their body temperature when acutely exposed to the cold. On the other hand BAT might be a target for the treatment of obesity and related diseases, as its pharmacological activation could allow release of excess energy stored in white adipose tissue depots. Energy dissipation in BAT depends on the activity of uncoupling protein 1 (UCP1), therefore a BAT-based obesity therapy requires a detailed understanding of structure and function of UCP1. Although UCP1 has been in the focus of research since its discovery, central questions concerning its mechanistic function and regulation are not yet resolved. They have been addressed in native mitochondria but also in several test systems, which are generally used to lower inter-experimental variability and to simplify analysis conditions. Different test systems have contributed to our current knowledge about UCP1 but of course all of them have certain limitations. We here provide an overview about research on UCP1 structure and function in test systems. So far, these have nearly exclusively been employed to study rodent and not human UCP1. Considering that the amino acid sequence of mouse and human UCP1 is only 79% identical, it will be essential to test whether the human version has a similarly high catalytic activity, allowing a relevant amount of energy dissipation in human BAT. Besides the issue of comparable mechanistic function a sufficiently high expression level of human UCP1 is a further prerequisite for anti-obesity therapeutic potential. Treatments which induce BAT hyperplasia and UCP1 expression in humans might therefore be equally important to discover as mere activators of the thermogenic process

Molecular evolution of UCP1 and the evolutionary history of mammalian non-shivering thermogenesis

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Uncoupling protein 1 (UCP1) is a mitochondrial anion carrier, expressed in brown adipose tissue (BAT) of Eutherians. UCP1 is responsible for uncoupling mitochondrial proton transport from the production of ATP, thereby dissipating heat; it is essential for non-shivering thermogenesis (NST) in mammalian BAT. UCP1 orthologs have been identified in non-Eutherian mammals, fish and amphibians. Yet, UCP1 has a unique function in Eutherians in that it is necessary in the production of heat (NST). As such, this study aims to determine the evolutionary mode of UCP1 in Eutherians, where there is clear evidence of UCP1-dependent NST in BAT.</p> <p>Results</p> <p>Models of adaptive evolution through phylogenetic analysis of amino acid sequences by maximum likelihood were implemented to determine the mode of UCP1 protein evolution in Eutherians. An increase in the rate of amino acid substitutions on the branch leading to Eutherians is observed, but is best explained by relaxed constraints, not positive selection. Further, evidence for branch and site heterogeneity in selection pressures, as well as divergent selection pressures between UCP1 and its paralogs (UCP2-3) is observed.</p> <p>Conclusion</p> <p>We propose that the unique thermogenic function of UCP1 in Eutherians may be best explained by neutral processes. Along with other evidence, this suggests that the primary biochemical properties of UCP1 may not differ between Eutherians and non-Eutherians.</p