The molecular basis of the mechanism of anemia resulting from the dominant CDA mutation in the Krüppel-like factor 1 gene.

Wydział BiologiiKrüppel-like factor 1 (KLF1) jest jednym z czynników transkrypcyjnych niezbędnych w trakcie powstawania i dojrzewania erytrocytów. Ma strukturę domenową i składa się z: N-końcowej domeny transaktywacyjnej rekrutującej kofaktory transkrypcji i C-końcowej domeny zbudowanej z trzech palców cynkowych rozpoznających 9nt motyw DNA: 5’NGG-GC/TG-NGG-4’. Mutacja E325K, znajdująca się w drugim palcu cynkowym KLF1 w pozycji funkcjonalnie zaangażowanej w interakcje z DNA, powoduje dziedziczną anemię dyserytropoetyczną (CDA) typu IV. Aby poznać molekularne podstawy mechanizmu leżącego u podstaw tej anemii wyznaczyłam motyw DNA rozpoznawany przez mutanta CDA-KF1. W tym celu wykorzystałam technikę CASTing w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji. Sekwencja konsensusowa została wyznaczona jako: 5’-NGG-GGG/T-G/TG/TG/T-3’. Różni się ona znacznie od motywu rozpoznawanego przez białko typu dzikiego: (1) zawiera guaninę w 5. pozycji, (2) jest zdegenerowana na 3’ końcu. Cechy te wskazują na wzajemnie wykluczające się preferencje wiązania dla CDA-KLF1 w porównaniu z WT-KLF1. W konsekwencji CDA-KLF1 rozpoznaje i wiąże ektopowe miejsca wiązania, co prowadzi do aktywacji puli genów nigdy nie aktywowanych przez WT-KLF1. Dowiodłam, że mutant CDA-KLF1 aktywuje transkrypcję genów, które zawierają nowo zidentyfikowany motyw w miejscach regulatorowych. Wśród tych genów mogą znaleźć się geny neomorficzne, spoza układu hematopoetycznego których ektopowa aktywacja może wyjaśnić obserwowany u pacjentów z CDA typu IV fenotyp.Krüppel like factor 1 (KLF1) is essential transcription factor for erythrocytes development. It consists of two domains: an N-terminal transactivation domain recruiting transcription cofactors and a C-terminal domain comprising three zinc fingers that recognize 9 nucleotide DNA motif: 5’NGG-GC/TG-NGG-3’. The E325K mutation, located in the second zinc finger of KLF1 at position functionally involved in interactions with DNA, causes congenital dyserythropoietic anemia (CDA) type IV. To decipher the molecular mechanism underlying CDA type IV anemia I determined the DNA consensus binding site for CDA-KLF1 mutant. To this end I used in vitro selection (CASTing), combined with new generation sequencing. The DNA binding motif was defined for CDA-KLF1 as: 5’-NGG-GGG/T-G/TG/TG/T-3’. This motif is significantly different from the motif recognized by wild type protein: (1) contains guanine in the 5th position, (2) is degenerated at the 3’ end. These features indicate mutually exclusive binding preferences for the CDA-KLF1 mutant compared to the WT-KLF1. As a consequence the CDA-KLF1 recognizes and binds ectopic DNA binding sites, which leads to the activation of genes not normally regulated by WT-KLF1. The CDA-KLF1 mutant participates in transcription activation of genes that have this newly defined DNA motif in regulatory regions. There may be neomorphic genes between them, outside the hematopoietic system, that ectopic activation would explain the phenotype of patients with CDA type IVPraca została sfinansowana z następujących środków: Grant NCN OPUS 5 2013/09/B/NZ1/01879: Nowy mechanizm ciężkiej niedokrwistości wywołanej zmutowaną formą czynnika transkrypcyjnego Erythroid Kruppel-like Factor (EKLF/KLF1); kierownik: dr hab. Mirosława Siatecka, prof. UA

A regulatory function of long non-coding RNAs in red blood cell development

In recent years it has been discovered that long non-coding RNAs are important regulators in many biological processes. In this review, we summarize the role of lncRNA in erythropoiesis. lncRNA are crucial for regulation of gene expression during both, proliferation and differentiation stages of red blood cell development. Many are regulated by erythroid-specific transcription factors and some are expressed in a developmental stage-specific manner. The majority of individually studied lncRNAs are involved in regulating the terminal maturation stages of red cell differentiation. Their regulatory function is accomplished by various mechanisms, including direct regulation in cis or trans by the lncRNA product or by the cis-localized presence of the lncRNA transcription itself. These add additional levels of regulation of gene expression during erythropoiesis

The association of VDAC with cell viability of PC12 model of Huntington’s disease

It is becoming increasingly apparent that mitochondria dysfunction plays an important role in pathogenesis of Huntington’s disease (HD) but the underlying mechanism is still elusive. Thus, there is a still need for further studies concerning the upstream events in the mitochondria dysfunction that could contribute to cell death observed in HD. Taking into account the fundamental role of the voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in mitochondria functioning it is reasonable to consider the channel as a crucial element in HD etiology. Therefore, we applied inducible PC12 cell model of HD to determine the relationship between the effect of expression of wild type and mutant huntingtin (Htt and mHtt, respectively) on cell survival and mitochondria functioning in intact cells under conditions of undergoing cell divisions. Because after 48h of Htt and mHtt expression differences in mitochondria functioning co-occurred with differences in the cell viability we decided to estimate the effect of Htt and mHtt expression lasted for 48h on VDAC functioning. Therefore we isolated VDAC from the cells and tested the preparations by black lipid membrane (BLM) system. We observed that the expression of mHtt, but not Htt, resulted in changes of the open state conductance and voltage-dependence when compared to control cells cultured in the absence of the expression. Importantly, for all the VDAC preparations we observed a dominant quantitative content of VDAC1 and the quantitative relationships between VDAC isoforms were not changed by Htt and mHtt expression. Thus, Htt and mHtt-mediated functional changes of VDAC, being predominantly VDAC1, which occur shortly after these protein appearance in cells may result in differences concerning mitochondria functioning and viability of cells expressing Htt and mHtt. The assumption is important for better understanding of cytotoxicity as well as cytoprotection mechanisms of potential clinical application