Strukturbasierte Entwicklung von Assaysystemen und Charakterisierung von orthosterischen und allosterischen Kinaseinhibitoren

Die Proteinkinasen stellen eine wichtige Enzymklasse für die Regulation der Signaltransduktion dar. Sie steuern diese diffizil regulierten, intrazellulären Signalkaskaden durch Übertragung der ?-Phosphatgruppe von ATP auf andere Proteine. Fehlregulationen dieser komplexen Stoffwechselwege können Krankheiten wie Krebs, Diabetes oder Autoimunkrankheiten verursachen. Somit gehören die Kinasen in den letzten Jahren zu den wichtigsten Zielproteinen der Pharmaindustrie. Die klassischen Kinaseinhibitoren binden an die ATP-Bindungstasche. Zwar können diese hoch affin an die entsprechenden Kinasen binden, jedoch fällt die Selektivität dieser Inhibitoren gegenüber anderen Vertretern der Kinasefamilie oft sehr gering aus. Außerdem treten bei den Kinaseinhibitoren, die als Medikamente in der Langzeitbehandlung von Tumoren Anwendung finden, häufig Wirkstoffresistenzen auf. Diese resultieren häufig auf Grund von Mutationen in der ATP-Bindungstasche, sodass die Bindungen zwischen Ligand und Protein geschwächt werden und der Inhibitor somit weniger potent ist. Zur Umgehung dieser Problematiken wird verstärkt nach neuen Substanzklassen mit alternativen Bindungsmodi gesucht. Darunter fallen irreversible Inhibitoren, Stabilisatoren der inaktiven Kinasekonformation sowie allosterische Kinaseinhibitoren. Die spezifische Identifizierung und Charakterisierung dieser speziellen Inhibitionstypen mit herkömmlichen Assaysystemen ist sehr aufwendig ist und erlaubt keine Durschmusterung größerer Substanzbibliotheken. Das Ziel dieser Arbeit war, für die drei verschiedenen Bindungsmechanismen Assaysysteme zu entwickeln, die eine direkte Identifizierung unterschiedlicher Inhibitionstypen zulassen. Hierfür wurden zunächst die zu adressierenden Kinasen cSrc, Abl und p38a rekombinant in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. Zur Detektion dienten verschiedene organische Moleküle als Sonden, die an die zu adressierende Bindungstasche binden. Hierbei wurde von unterschiedlichen Messprinzipien wie Fluoreszenz, Chemilumineszenz und Fluoreszenzpolarisation Gebrauch gemacht. Zur möglichen HTS-Anwendung wurden die Assaysysteme in 384er Mikrotiterplatten etabliert und mit bekannten Inhibitoren validiert. Die Bindung relevanter Liganden wurde zur Ableitung von Strukturaktivitätsbeziehungen röntgenkristallographisch untersucht. 1. Einfluss von irreversiblen Inhibitoren auf wirkstoffresistente Kinasemutanten Irreversible Inhibitoren folgen durch graduelle Elimination des Anteils an enzymatisch aktivem Enzym einer zeitabhängigen Kinetik. Somit ist die IC50-Bestimmung besonders bei hoch potenten Inhibitoren kein geeignetes Maß zur Charakterisierung der Inhibitionsstärke. Deshalb wurde ein Assaysystem entwickelt, dass auf Eigenfluoreszenz irreversibler Inhibitoren beruht. Bei Ausbildung der kovalenten Bindung einer elektrophilen Gruppe mit der Seitenkette eines spezifischen Cysteins in der ATP-Bindungstasche kommt es zur Änderung der intrinsischen Fluoreszenz des Inhibitormoleküls. Dieses diente als Detektionssystem und ermöglichte eine Klassifizierung irreversibler Verbindungen anhand ihrer Reaktivität durch die Detektion der Komplexbildungsgeschwindigkeit. Zusätzlich konnte hiermit der Einfluss einer zur Wirkstoffresistenz führenden Mutation in der ATP-Bindungstasche untersucht werden. Es konnte unabhängig von katalytischer Aktivität gezeigt werden, dass die raumeinnehmende Aminosäure die Geschwindigkeit der Komplexbildung von Inhibitor und Enzym herabsetzt, was auf eine sterische Interferenz zurückzuführen ist. 2. Detektion von Stabilisatoren der inaktiven Kinasekonformation Viele Kinasen liegen im inaktiven Zustand in einer speziellen Konformation vor die von der aktiven stark abweicht. Hierbei wird entweder die Anlagerung von ATP oder die Katalyse des Phosphatgruppentransfers unterbunden. Strukturell gesehen öffnet sich in der inaktiven Konformation ein hydrophober Bereich in der Nähe der ATP-Bindungstasche. Dieser ist für Liganden zugänglich, die die inaktive Kinasekonformation stabilisieren. Solche Liganden sind für die p38a Kinase bereits bekannt. Basierend auf dieser Information wurde eine Sonde entwickelt, die an die inaktive Kinasekonformation der p38a Kinase bindet. Das Assaysystem basiert auf Enzym-Fragment-Komplementation, bei der eine verkürzte und damit inaktive Variante der ß-Galactosidase eingesetzt wird. Zusätzlich enthält die Sonde ein Peptid-Fragment der ß-Galactosidase. Wird die Sonde von ihrer Bindungstasche verdrängt, liegt diese frei im System vor und kann einen Komplex mit der verkürzten ß-Galactosidase eingehen. Diese wird dadurch enzymatisch aktiv, was mit Chemilumineszenz nachgewiesen werden kann. Das System wurde zum Test einer Reihe von Inhibitoren mit unterschiedlichen Bindungsmechanismen verwendet. Für schwache Liganden der inaktiven Konformation eignet sich dieser Assay besonders gut, da bei vielen anderen Assaysystemen die Kinase in der aktiven Konformation vorliegt und diese Liganden somit übersehen werden können. Es konnte gezeigt werden, dass der Ligand der Sonde auch an weitere Kinasen bindet. Daraufhin wurde dieses Assaysystem für insgesamt fünf verschiedene Kinasen aufgebaut. 3. Assaysystem zur Detektion von allosterischen Inhibitoren der Abl-Kinase Die Abl-Kinase verfügt über einen Autoinhibitionsmechanismus, bei der die inaktive Kinasekonformation durch SH2- und SH3-Domänen sowie durch eine myristoylierte Region, die an die sogenannte Myristoylierungstasche bindet, stabilisiert wird. Adrian et al. haben gezeigt, dass auch kleine organische Moleküle an diese Region binden können und die Aktivität der Kinase herabsetzen. Um tiefere Einblicke in diese Regulationsform und deren Liganden zu erhalten, wurde ein Assaysystem zur Detektion von Liganden der Myristoylbindungstasche aufgebaut. Der auf Verdrängung einer Sonde beruhende Assay basiert auf Fluoreszenzpolarisation. Hierfür wurde eine Sonde generiert, die aus einem Liganden der Myristoylierungstasche sowie dem Fluorophor Fluoreszein besteht. Bei Verdrängung der Sonde durch weitere Liganden liegt diese frei in Lösung vor wodurch sich die Fluoreszenzpolarisation ändert. Dies dient als Maß für die Verdrängung der Sonde durch eine getestete Substanz. Da dieser Assay mit nur wenigen Pipettierschritten durchgeführt werden kann, konnten sehr einfach viele Moleküle in kurzer Zeit getestet werden. Die Ergebnisse waren äußerst robust und reproduzierbar

Extrusion-based 3D printing of osteoinductive scaffolds with a spongiosa-inspired structure

Critical-sized bone defects resulting from trauma, inflammation, and tumor resections are individual in their size and shape. Implants for the treatment of such defects have to consider biomechanical and biomedical factors, as well as the individual conditions within the implantation site. In this context, 3D printing technologies offer new possibilities to design and produce patient-specific implants reflecting the outer shape and internal structure of the replaced bone tissue. The selection or modification of materials used in 3D printing enables the adaption of the implant, by enhancing the osteoinductive or biomechanical properties. In this study, scaffolds with bone spongiosa-inspired structure for extrusion-based 3D printing were generated. The computer aided design process resulted in an up scaled and simplified version of the bone spongiosa. To enhance the osteoinductive properties of the 3D printed construct, polycaprolactone (PCL) was combined with 20% (wt) calcium phosphate nano powder (CaP). The implants were designed in form of a ring structure and revealed an irregular and interconnected porous structure with a calculated porosity of 35.2% and a compression strength within the range of the natural cancellous bone. The implants were assessed in terms of biocompatibility and osteoinductivity using the osteosarcoma cell line MG63 and patient-derived mesenchymal stem cells in selected experiments. Cell growth and differentiation over 14 days were monitored using confocal laser scanning microscopy, scanning electron microscopy, deoxyribonucleic acid (DNA) quantification, gene expression analysis, and quantitative assessment of calcification. MG63 cells and human mesenchymal stem cells (hMSC) adhered to the printed implants and revealed a typical elongated morphology as indicated by microscopy. Using DNA quantification, no differences for PCL or PCL-CaP in the initial adhesion of MG63 cells were observed, while the PCL-based scaffolds favored cell proliferation in the early phases of culture up to 7 days. In contrast, on PCL-CaP, cell proliferation for MG63 cells was not evident, while data from PCR and the levels of calcification, or alkaline phosphatase activity, indicated osteogenic differentiation within the PCL-CaP constructs over time. For hMSC, the highest levels in the total calcium content were observed for the PCL-CaP constructs, thus underlining the osteoinductive properties

Evaluation of bone allograft processing methods: Impact on decellularization efficacy, biocompatibility and mesenchymal stem cell functionality.

In an ever-aging society the demand for bone-defect filling grafts continues to gain in importance. While autologous grafting still prevails as the gold standard, allografts and xenografts present viable alternatives with promising results. Physiochemical properties of a graft strongly depend on the processing method such as the decellularization protocol. In addition, the physiochemical characteristics are critical factors for a successful integration of the graft after the implantation and might influence mesenchymal stem cell function in therapeutic approaches combining grafts and autologous mesenchymal stem cells (MSCs). Several decellularization methods have been proposed, however it still remains unclear which method results in favorable physiochemical properties or might be preferred in stem cell applications. In the first part of this study we compared two decellularization approaches resulting in chemically processed allografts (CPAs) or sonication-based processed allografts (SPAs). Each decellularization approach was compared for its decellularization efficacy and its influence on the grafts' surface texture and composition. In the second part of this study biocompatibility of grafts was assessed by testing the effect of extraction medium on MSC viability and comparing them to commercially available allografts and xenografts. Additionally, grafts' performance in terms of MSC functionality was assessed by reseeding with MSCs pre-differentiated in osteogenic medium and determining cell adhesion, proliferation, as well as alkaline phosphatase (ALP) activity and the degree of mineralization. In summary, results indicate a more effective decellularization for the SPA approach in comparison to the CPA approach. Even though SPA extracts induced a decrease in MSC viability, MSC performance after reseeding was comparable to commercially available grafts based on DNA quantification, alkaline phosphatase activity and quantification of mineralization. Commercial Tutoplast allografts showed overall the best effects on MSC functionality as indicated by extraction biocompatibility testing as well as by comparing proliferation and osteogenic differentiation

High-Throughput Screening To Identify Inhibitors Which Stabilize Inactive Kinase Conformations in p38α

Small molecule kinase inhibitors are an attractive means to modulate kinase activities in medicinal chemistry and chemical biology research. In the physiological setting of a cell, kinase function is orchestrated by a plethora of regulatory processes involving the structural transition of kinases between inactive and enzymatically competent conformations and vice versa. The development of novel kinase inhibitors is mainly fostered by high-throughput screening initiatives where the small molecule perturbation of the phosphorylation reaction is measured to identify inhibitors. Such setups require enzymatically active kinase preparations and present a risk of solely identifying classical ATP-competitive Type I inhibitors. Here we report the high-throughput screening of a library of similar to 35000 small organic molecules with an assay system that utilizes enzymatically inactive human p38 alpha MAP kinase to detect stabilizers of the pharmacologically more desirable DFG-out conformation. We used protein X-ray crystallography to characterize the binding mode of hit compounds and reveal structural features which explain how these ligands stabilize and/or induce the DFG-out conformation. Lastly, we show that although some of the hit compounds were confirmed by protein X-ray crystallography, they were not detected in classic phosphorylation assays, thus validating the unique sensitivity of the assay system used in this study and highlighting the potential of screening with inactive kinase preparations

Graphene Oxide Framework Structures and Coatings: Impact on Cell Adhesion and Pre-Vascularization Processes for Bone Grafts

Graphene oxide (GO) is a promising material for bone tissue engineering, but the validation of its molecular biological effects, especially in the context of clinically applied materials, is still limited. In this study, we compare the effects of graphene oxide framework structures (F-GO) and reduced graphene oxide-based framework structures (F-rGO) as scaffold material with a special focus on vascularization associated processes and mechanisms in the bone. Highly porous networks of zinc oxide tetrapods serving as sacrificial templates were used to create F-GO and F-rGO with porosities >99% consisting of hollow interconnected microtubes. Framework materials were seeded with human mesenchymal stem cells (MSC), and the cell response was evaluated by confocal laser scanning microscopy (CLSM), deoxyribonucleic acid (DNA) quantification, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and alkaline phosphatase activity (ALP) to define their impact on cellular adhesion, osteogenic differentiation, and secretion of vascular growth factors. F-GO based scaffolds improved adhesion and growth of MSC as indicated by CLSM and DNA quantification. Further, F-GO showed a better vascular endothelial growth factor (VEGF) binding capacity and improved cell growth as well as the formation of microvascular capillary-like structures in co-cultures with outgrowth endothelial cells (OEC). These results clearly favored non-reduced graphene oxide in the form of F-GO for bone regeneration applications. To study GO in the context of a clinically used implant material, we coated a commercially available xenograft (Bio-Oss® block) with GO and compared the growth of MSC in monoculture and in coculture with OEC to the native scaffold. We observed a significantly improved growth of MSC and formation of prevascular structures on coated Bio-Oss®, again associated with a higher VEGF binding capacity. We conclude that graphene oxide coating of this clinically used, but highly debiologized bone graft improves MSC cell adhesion and vascularization