New Secretory Peroxidases and Peroxygenases from Saprotrophic Fungi of Kenyan Forests

Die vorliegende Dissertation befasst sich vor dem Hintergrund von pilzlicher Ökophysiologie und Umweltbiotechnologie mit der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von neuartigen Oxidoreduktasen aus kenianischen Pilzen (Eumycota). Unter Verwendung von selektiven, antibiotikahaltigen Agarmedien wurde 2016 eine Stammsammlung von 43 pilzlichen Isolaten angelegt, die Totholz, Laubstreu und Boden besiedelnde Arten umfasst und drei verschiedene kenianische Waldtypen und Biodiversitätsschwerpunkte berücksichtigt (ostafrikanische Regen-, Berg- und Küstenwälder). Die Isolate gehörten zu 21 Familien aus drei (Unter)stämmen: Basidiomycota, Ascomycota und Mucoromycotina. Unter ihnen befanden sich Weißfäulepilze und Streuzersetzer (aus den Familien Polyporaceae und Strophariceae), ein polyporaler Braunfäulepilz (Fomitopsis meliae) und zwei Vertreter der Familie Xylariaceae, die eine Moderfäule hervorrufen. Auf Grundlage morphologischer und molekularbiologischer Analysen konnte eine neue Art der Blätterpilz-Gattung Psathyrella identifiziert und als P. aberdarensis beschrieben werden. Extrazelluläre Aktivitäten von Unspezifischer Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) and DyP-Typ-Peroxidase (DyP, EC 1.11.1.19) wurden für einige der pilzlichen Isolate nachgewiesen, u.a. für P. aberdarensis (PabUPO) und den ascomycetalen Moderfäulepilz Xylaria grammica (XgrDyP). Die zugehörigen Enzymproteine wurden gereinigt und biochemisch characterisiert. Die PabUPOs werden in Form von drei verschiedenen Isoenzymen/Isoformen exprimiert und realisieren ungewöhnlich breite pH-Profile bei entsprechend hoher Enzymstabilität. Sie gehören zur Proteinfamilie der “langen” UPOs und katalysieren typische Peroxygenierungen, u.a. die Oxidation von Alkoholen, die Spaltung von Ethern, die Demethylenierung, die Oxygenierung aromatischer Ringe und – darüber hinaus – die Oxidation von Formylfurancarbonsäure zu Furandicarbonsäure (eine spezifische Reaktion, die für die Herstellung von biobasierten Polyestern aus nachwachsenden Rohstoffen von Bedeutung ist). Bei der XgrDyP handelt es sich um die erste Wildtyp-DyP eines Ascomyceten; sie ist in der Lage, Peroxidase-Substrate wie ABTS und 2,6-Dimethoxyphenol, aber auch den Anthrachinon-Farbstoff Reactive Blue 5, Veratrylalkohol, und – bemerkenswerterweise – Mangan (Mn2+) zu oxidieren, was auf neue physiologische Funktionen dieses Enzymtyps hinweist. Die Genome der beiden Enzymbildner wurden sequenziert und annotiert, was die Identifizierung der zugehörigen Enzyme-kodierenden Gene erlaubte. Neben den beiden exprimierten PabUPO-Genen wurden 46 weitere putative UPO-Sequencen im Psathyrella-Genom gefunden. Aufgrund des Fehlens ligninolytischer Klasse-II-Peroxidasen in den Genomen beider Pilze wird angenommen, dass die charakterisierten Hämperoxidasen von ökophysiologischer Bedeutung für alternative Wege des Abbaus von Lignozellulosen oder Humus sind. Auf Basis des gefundenen Kernbestands an lignocellulolytischen CAZy-Enzymen (d.h. Cellulasen, lytische Polysaccharid-Monooxygenasen, Laccase, H2O2-bildende Oxidasen), können P. aberdarensis and X. grammica den ökophysiologischen Gruppen der streuzersetzenden Weißfäulepilze bzw. holzbesiedelnden Moderfäulepilze zugerechnet werden.:TABLE OF CONTENTS LIST OF ABBREVIATIONS V ZUSAMMENFASSUNG VII SUMMARY IX MUHTASARI XI 1 INTRODUCTION 1 2 MATERIAL AND METHODS 35 3 RESULTS 54 4 DISCUSSION 105 5 CONCLUSION AND OUTLOOK 133 6 REFERENCES 137 7 APPENDIX 156The present dissertation deals, against the background of fungal eco-physiology and environmental biotechnology, with the isolation, purification and characterization of new fungal oxidoreducatses from Kenyan fungi (Eumycota). By using selective agar media supplemented with antibiotics, a culture collection comprising 43 fungal isolates dwelling in deadwood, leaf-litter and soil was established in 2016, considering three different Kenyan forest types and biodiversity hotspots (East African rainforest, mountain and coastal forests). The isolates turned out to belong to 21 families of the (sub)phyla Basidiomycota, Ascomycota and Mucoromycotina. Among them were white-rot and litter-decomposing fungi (from the families Polyporaceae and Strophariceae), a polyporous brown-rot species (Fomitopsis meliae) and two members of the family Xylariaceae causing soft-rot. By morphological and molecular analyses, a new species of the agaric genus Psathyrella was identified and described as Psathyrella aberdarensis. Extracellular activities of unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) and DyP-type peroxidase (DyP, EC 1.11.1.19) were demonstrated for a few of the fungal isolates, among them P. aberdarensis (PabUPO) and the soft-rot ascomycete Xylaria grammica (XgrDyP), respectively. The corresponding enzyme proteins were purified and characterized. PabUPOs occur in form of three different isoenzymes/isoforms realizing unusually broad pH-profiles and stabilities. They belong to the clade of ‘long’ UPOs and catalyze typical peroxygenations, i.e. alcohol oxidation, ether cleavage, demethylenation, aromatic ring oxygenation, and beyond that, the oxidation of formylfuran carboxylic acid into furandicarboxylic acid (a specific reaction in the preparation of bio-based polyesters from renewable building blocks). XgrDyP is the first wild-type DyP reported for an ascomycetous fungus and was found to oxidize peroxidase substrates such as ABTS and 2,6-DMP but also Reactive Blue 5, veratryl alcohol and notably manganese (Mn2+), suggesting novel physiological functions of this enzyme type. The genomes of both producer species were sequenced and annotated, which allowed the identification of the corresponding enzyme-encoding genes. Besides the two expressed PabUPO genes, a further 46 putative UPO sequences were identified in the Psathyrella genome. Due to the absence of ligninolytic class II peroxidases in the genomes of both fungi, the characterized heme peroxidases may be of eco-physiological relevance for alternative pathways degrading lignocellulosic materials or humus. Based on the core set of lignocellulolytic CAZy enzymes (i.e. cellulases, lytic monosaccharide monooxygenases, laccase, H2O2-generating oxidases), P. aberdarensis and X. grammica can be classified within the eco-physiological groups of litter-decomposing white-rot and wood-colonizing soft-rot fungi, respectively.:TABLE OF CONTENTS LIST OF ABBREVIATIONS V ZUSAMMENFASSUNG VII SUMMARY IX MUHTASARI XI 1 INTRODUCTION 1 2 MATERIAL AND METHODS 35 3 RESULTS 54 4 DISCUSSION 105 5 CONCLUSION AND OUTLOOK 133 6 REFERENCES 137 7 APPENDIX 15

New Secretory Peroxidases and Peroxygenases from Saprotrophic Fungi of Kenyan Forests

Die vorliegende Dissertation befasst sich vor dem Hintergrund von pilzlicher Ökophysiologie und Umweltbiotechnologie mit der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von neuartigen Oxidoreduktasen aus kenianischen Pilzen (Eumycota). Unter Verwendung von selektiven, antibiotikahaltigen Agarmedien wurde 2016 eine Stammsammlung von 43 pilzlichen Isolaten angelegt, die Totholz, Laubstreu und Boden besiedelnde Arten umfasst und drei verschiedene kenianische Waldtypen und Biodiversitätsschwerpunkte berücksichtigt (ostafrikanische Regen-, Berg- und Küstenwälder). Die Isolate gehörten zu 21 Familien aus drei (Unter)stämmen: Basidiomycota, Ascomycota und Mucoromycotina. Unter ihnen befanden sich Weißfäulepilze und Streuzersetzer (aus den Familien Polyporaceae und Strophariceae), ein polyporaler Braunfäulepilz (Fomitopsis meliae) und zwei Vertreter der Familie Xylariaceae, die eine Moderfäule hervorrufen. Auf Grundlage morphologischer und molekularbiologischer Analysen konnte eine neue Art der Blätterpilz-Gattung Psathyrella identifiziert und als P. aberdarensis beschrieben werden. Extrazelluläre Aktivitäten von Unspezifischer Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) and DyP-Typ-Peroxidase (DyP, EC 1.11.1.19) wurden für einige der pilzlichen Isolate nachgewiesen, u.a. für P. aberdarensis (PabUPO) und den ascomycetalen Moderfäulepilz Xylaria grammica (XgrDyP). Die zugehörigen Enzymproteine wurden gereinigt und biochemisch characterisiert. Die PabUPOs werden in Form von drei verschiedenen Isoenzymen/Isoformen exprimiert und realisieren ungewöhnlich breite pH-Profile bei entsprechend hoher Enzymstabilität. Sie gehören zur Proteinfamilie der “langen” UPOs und katalysieren typische Peroxygenierungen, u.a. die Oxidation von Alkoholen, die Spaltung von Ethern, die Demethylenierung, die Oxygenierung aromatischer Ringe und – darüber hinaus – die Oxidation von Formylfurancarbonsäure zu Furandicarbonsäure (eine spezifische Reaktion, die für die Herstellung von biobasierten Polyestern aus nachwachsenden Rohstoffen von Bedeutung ist). Bei der XgrDyP handelt es sich um die erste Wildtyp-DyP eines Ascomyceten; sie ist in der Lage, Peroxidase-Substrate wie ABTS und 2,6-Dimethoxyphenol, aber auch den Anthrachinon-Farbstoff Reactive Blue 5, Veratrylalkohol, und – bemerkenswerterweise – Mangan (Mn2+) zu oxidieren, was auf neue physiologische Funktionen dieses Enzymtyps hinweist. Die Genome der beiden Enzymbildner wurden sequenziert und annotiert, was die Identifizierung der zugehörigen Enzyme-kodierenden Gene erlaubte. Neben den beiden exprimierten PabUPO-Genen wurden 46 weitere putative UPO-Sequencen im Psathyrella-Genom gefunden. Aufgrund des Fehlens ligninolytischer Klasse-II-Peroxidasen in den Genomen beider Pilze wird angenommen, dass die charakterisierten Hämperoxidasen von ökophysiologischer Bedeutung für alternative Wege des Abbaus von Lignozellulosen oder Humus sind. Auf Basis des gefundenen Kernbestands an lignocellulolytischen CAZy-Enzymen (d.h. Cellulasen, lytische Polysaccharid-Monooxygenasen, Laccase, H2O2-bildende Oxidasen), können P. aberdarensis and X. grammica den ökophysiologischen Gruppen der streuzersetzenden Weißfäulepilze bzw. holzbesiedelnden Moderfäulepilze zugerechnet werden.:TABLE OF CONTENTS LIST OF ABBREVIATIONS V ZUSAMMENFASSUNG VII SUMMARY IX MUHTASARI XI 1 INTRODUCTION 1 2 MATERIAL AND METHODS 35 3 RESULTS 54 4 DISCUSSION 105 5 CONCLUSION AND OUTLOOK 133 6 REFERENCES 137 7 APPENDIX 156The present dissertation deals, against the background of fungal eco-physiology and environmental biotechnology, with the isolation, purification and characterization of new fungal oxidoreducatses from Kenyan fungi (Eumycota). By using selective agar media supplemented with antibiotics, a culture collection comprising 43 fungal isolates dwelling in deadwood, leaf-litter and soil was established in 2016, considering three different Kenyan forest types and biodiversity hotspots (East African rainforest, mountain and coastal forests). The isolates turned out to belong to 21 families of the (sub)phyla Basidiomycota, Ascomycota and Mucoromycotina. Among them were white-rot and litter-decomposing fungi (from the families Polyporaceae and Strophariceae), a polyporous brown-rot species (Fomitopsis meliae) and two members of the family Xylariaceae causing soft-rot. By morphological and molecular analyses, a new species of the agaric genus Psathyrella was identified and described as Psathyrella aberdarensis. Extracellular activities of unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) and DyP-type peroxidase (DyP, EC 1.11.1.19) were demonstrated for a few of the fungal isolates, among them P. aberdarensis (PabUPO) and the soft-rot ascomycete Xylaria grammica (XgrDyP), respectively. The corresponding enzyme proteins were purified and characterized. PabUPOs occur in form of three different isoenzymes/isoforms realizing unusually broad pH-profiles and stabilities. They belong to the clade of ‘long’ UPOs and catalyze typical peroxygenations, i.e. alcohol oxidation, ether cleavage, demethylenation, aromatic ring oxygenation, and beyond that, the oxidation of formylfuran carboxylic acid into furandicarboxylic acid (a specific reaction in the preparation of bio-based polyesters from renewable building blocks). XgrDyP is the first wild-type DyP reported for an ascomycetous fungus and was found to oxidize peroxidase substrates such as ABTS and 2,6-DMP but also Reactive Blue 5, veratryl alcohol and notably manganese (Mn2+), suggesting novel physiological functions of this enzyme type. The genomes of both producer species were sequenced and annotated, which allowed the identification of the corresponding enzyme-encoding genes. Besides the two expressed PabUPO genes, a further 46 putative UPO sequences were identified in the Psathyrella genome. Due to the absence of ligninolytic class II peroxidases in the genomes of both fungi, the characterized heme peroxidases may be of eco-physiological relevance for alternative pathways degrading lignocellulosic materials or humus. Based on the core set of lignocellulolytic CAZy enzymes (i.e. cellulases, lytic monosaccharide monooxygenases, laccase, H2O2-generating oxidases), P. aberdarensis and X. grammica can be classified within the eco-physiological groups of litter-decomposing white-rot and wood-colonizing soft-rot fungi, respectively.:TABLE OF CONTENTS LIST OF ABBREVIATIONS V ZUSAMMENFASSUNG VII SUMMARY IX MUHTASARI XI 1 INTRODUCTION 1 2 MATERIAL AND METHODS 35 3 RESULTS 54 4 DISCUSSION 105 5 CONCLUSION AND OUTLOOK 133 6 REFERENCES 137 7 APPENDIX 15

New Secretory Peroxidases and Peroxygenases from Saprotrophic Fungi of Kenyan Forests

Die vorliegende Dissertation befasst sich vor dem Hintergrund von pilzlicher Ökophysiologie und Umweltbiotechnologie mit der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von neuartigen Oxidoreduktasen aus kenianischen Pilzen (Eumycota). Unter Verwendung von selektiven, antibiotikahaltigen Agarmedien wurde 2016 eine Stammsammlung von 43 pilzlichen Isolaten angelegt, die Totholz, Laubstreu und Boden besiedelnde Arten umfasst und drei verschiedene kenianische Waldtypen und Biodiversitätsschwerpunkte berücksichtigt (ostafrikanische Regen-, Berg- und Küstenwälder). Die Isolate gehörten zu 21 Familien aus drei (Unter)stämmen: Basidiomycota, Ascomycota und Mucoromycotina. Unter ihnen befanden sich Weißfäulepilze und Streuzersetzer (aus den Familien Polyporaceae und Strophariceae), ein polyporaler Braunfäulepilz (Fomitopsis meliae) und zwei Vertreter der Familie Xylariaceae, die eine Moderfäule hervorrufen. Auf Grundlage morphologischer und molekularbiologischer Analysen konnte eine neue Art der Blätterpilz-Gattung Psathyrella identifiziert und als P. aberdarensis beschrieben werden. Extrazelluläre Aktivitäten von Unspezifischer Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) and DyP-Typ-Peroxidase (DyP, EC 1.11.1.19) wurden für einige der pilzlichen Isolate nachgewiesen, u.a. für P. aberdarensis (PabUPO) und den ascomycetalen Moderfäulepilz Xylaria grammica (XgrDyP). Die zugehörigen Enzymproteine wurden gereinigt und biochemisch characterisiert. Die PabUPOs werden in Form von drei verschiedenen Isoenzymen/Isoformen exprimiert und realisieren ungewöhnlich breite pH-Profile bei entsprechend hoher Enzymstabilität. Sie gehören zur Proteinfamilie der “langen” UPOs und katalysieren typische Peroxygenierungen, u.a. die Oxidation von Alkoholen, die Spaltung von Ethern, die Demethylenierung, die Oxygenierung aromatischer Ringe und – darüber hinaus – die Oxidation von Formylfurancarbonsäure zu Furandicarbonsäure (eine spezifische Reaktion, die für die Herstellung von biobasierten Polyestern aus nachwachsenden Rohstoffen von Bedeutung ist). Bei der XgrDyP handelt es sich um die erste Wildtyp-DyP eines Ascomyceten; sie ist in der Lage, Peroxidase-Substrate wie ABTS und 2,6-Dimethoxyphenol, aber auch den Anthrachinon-Farbstoff Reactive Blue 5, Veratrylalkohol, und – bemerkenswerterweise – Mangan (Mn2+) zu oxidieren, was auf neue physiologische Funktionen dieses Enzymtyps hinweist. Die Genome der beiden Enzymbildner wurden sequenziert und annotiert, was die Identifizierung der zugehörigen Enzyme-kodierenden Gene erlaubte. Neben den beiden exprimierten PabUPO-Genen wurden 46 weitere putative UPO-Sequencen im Psathyrella-Genom gefunden. Aufgrund des Fehlens ligninolytischer Klasse-II-Peroxidasen in den Genomen beider Pilze wird angenommen, dass die charakterisierten Hämperoxidasen von ökophysiologischer Bedeutung für alternative Wege des Abbaus von Lignozellulosen oder Humus sind. Auf Basis des gefundenen Kernbestands an lignocellulolytischen CAZy-Enzymen (d.h. Cellulasen, lytische Polysaccharid-Monooxygenasen, Laccase, H2O2-bildende Oxidasen), können P. aberdarensis and X. grammica den ökophysiologischen Gruppen der streuzersetzenden Weißfäulepilze bzw. holzbesiedelnden Moderfäulepilze zugerechnet werden.:TABLE OF CONTENTS LIST OF ABBREVIATIONS V ZUSAMMENFASSUNG VII SUMMARY IX MUHTASARI XI 1 INTRODUCTION 1 2 MATERIAL AND METHODS 35 3 RESULTS 54 4 DISCUSSION 105 5 CONCLUSION AND OUTLOOK 133 6 REFERENCES 137 7 APPENDIX 156The present dissertation deals, against the background of fungal eco-physiology and environmental biotechnology, with the isolation, purification and characterization of new fungal oxidoreducatses from Kenyan fungi (Eumycota). By using selective agar media supplemented with antibiotics, a culture collection comprising 43 fungal isolates dwelling in deadwood, leaf-litter and soil was established in 2016, considering three different Kenyan forest types and biodiversity hotspots (East African rainforest, mountain and coastal forests). The isolates turned out to belong to 21 families of the (sub)phyla Basidiomycota, Ascomycota and Mucoromycotina. Among them were white-rot and litter-decomposing fungi (from the families Polyporaceae and Strophariceae), a polyporous brown-rot species (Fomitopsis meliae) and two members of the family Xylariaceae causing soft-rot. By morphological and molecular analyses, a new species of the agaric genus Psathyrella was identified and described as Psathyrella aberdarensis. Extracellular activities of unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) and DyP-type peroxidase (DyP, EC 1.11.1.19) were demonstrated for a few of the fungal isolates, among them P. aberdarensis (PabUPO) and the soft-rot ascomycete Xylaria grammica (XgrDyP), respectively. The corresponding enzyme proteins were purified and characterized. PabUPOs occur in form of three different isoenzymes/isoforms realizing unusually broad pH-profiles and stabilities. They belong to the clade of ‘long’ UPOs and catalyze typical peroxygenations, i.e. alcohol oxidation, ether cleavage, demethylenation, aromatic ring oxygenation, and beyond that, the oxidation of formylfuran carboxylic acid into furandicarboxylic acid (a specific reaction in the preparation of bio-based polyesters from renewable building blocks). XgrDyP is the first wild-type DyP reported for an ascomycetous fungus and was found to oxidize peroxidase substrates such as ABTS and 2,6-DMP but also Reactive Blue 5, veratryl alcohol and notably manganese (Mn2+), suggesting novel physiological functions of this enzyme type. The genomes of both producer species were sequenced and annotated, which allowed the identification of the corresponding enzyme-encoding genes. Besides the two expressed PabUPO genes, a further 46 putative UPO sequences were identified in the Psathyrella genome. Due to the absence of ligninolytic class II peroxidases in the genomes of both fungi, the characterized heme peroxidases may be of eco-physiological relevance for alternative pathways degrading lignocellulosic materials or humus. Based on the core set of lignocellulolytic CAZy enzymes (i.e. cellulases, lytic monosaccharide monooxygenases, laccase, H2O2-generating oxidases), P. aberdarensis and X. grammica can be classified within the eco-physiological groups of litter-decomposing white-rot and wood-colonizing soft-rot fungi, respectively.:TABLE OF CONTENTS LIST OF ABBREVIATIONS V ZUSAMMENFASSUNG VII SUMMARY IX MUHTASARI XI 1 INTRODUCTION 1 2 MATERIAL AND METHODS 35 3 RESULTS 54 4 DISCUSSION 105 5 CONCLUSION AND OUTLOOK 133 6 REFERENCES 137 7 APPENDIX 15

Unlocking water potential in drylands: Quicklime and fly ash enhance soil microbiome structure, ecological networks and function in acid mine drainage water-irrigated agriculture

In water-stressed regions, treated acid mine drainage (AMD) water for irrigated agriculture is a potential solution to address freshwater scarcity. However, a significant knowledge gap exists on the short and long-term effects of treated AMD water on soil health. This study used high-throughput Illumina sequencing and predictive metagenomic profiling to investigate the impact of untreated AMD (AMD), quicklime- (A1Q and A2Q) and quicklime and fly ash-treated AMD water (AFQ) irrigation on soil bacterial diversity, co-occurrence networks and function. Results showed that untreated AMD water significantly increased soil acidity, electrical conductivity (EC), sulfate (SO42−), and heavy metals (HM), including reduced microbial diversity, disrupted interaction networks, and functional capacity. pH, EC, Cu, and Pb were identified as key environmental factors shaping soil microbial diversity and structure. Predominantly, Pseudomonas, Ralstonia picketti, Methylotenera KB913035, Brevundimonas vesicularis, and Methylobacterium oryzae, known for their adaptability to acidic conditions and metal resistance, were abundant in AMD soils. However, soils irrigated with treated AMD water exhibited significantly reduced acidity (pH > 6.5), HM and SO42− levels, with an enrichment of a balanced bacterial taxa associated with diverse functions related to soil health and agricultural productivity. These taxa included Sphingomonas, Pseudoxanthomonas, Achromobacter, Microbacterium, Rhodobacter, Clostridium, Massillia, Rhizobium, Paenibacillus, and Hyphomicrobium. Moreover, treated AMD water contributed to higher connectivity and balance within soil bacterial co-occurrence networks compared to untreated AMD water. These results show that quicklime/fly ash treatments can help lessen impacts of AMD water on soil microbiome and health, suggesting its potential for irrigated agriculture in water-scarce regions