Oriented immobilization of peptide-N-glycosidase F on a monolithic support for glycosylation analysis

In this paper, we report on a novel oriented peptide-N-glycosidase F (PNGase F) immobilization approach onto methacrylate based monolithic support for rapid, reproducible and efficient release of the N-linked carbohydrate moieties from glycoproteins. The glutathione-S-transferase-fusion PNGase F (PNGase F-GST) was expressed in Escherichia coli using regular vector technology. The monolithic pore surface was functionalized with glutathione via a succinimidyl-6-(iodoacetyl-amino)-hexanoate linker and the specific affinity of GST toward glutathione was utilized for the oriented coupling. This novel immobilization procedure was compared with reductive amination technique commonly used for non-oriented enzyme immobilization via primary amine functionalities. Both coupling approaches were compared using enzymatic treatment of several glycoproteins, such as ribonuclease B, fetuin and immunoglobulin G followed by MALDI/MS and CE-LIF analysis of the released glycans. Orientedly immobilized PNGase F via GST-glutathione coupling showed significantly higher activity, remained stable for several months, and allowed rapid release of various types of glycans (high-mannose, core fucosylated, sialylated, etc.) from glycoproteins. Complete protein deglycosylation was obtained as fast as in several seconds when using flow-through immobilized microreactors

Apoptótikus sejtek fagocitózisát szabályozó folyamatok molekuláris mechanizmusa = Molecular mechanism in the regulation of the phagocytosis in apoptotic cells

A szervezetben naponta elhaló sok milliárd sejt hatékony eltávolítása a feltétele annak, hogy ne alakuljanak ki kóros gyulladásos és autoimmun kórképek. Kísérleteink segítségével számos eddig ismeretlen elemét tártuk fel az eltakarító rendszernek. Megállapítottuk, hogy a folyamat szabályozásában lényeges szerepet játszik a fehérjéket keresztkötő transzglutamináz enzim, annak hiányában autoimmun reakció jelenik meg. A transzglutamináz, amelynek új szubsztrátjait ismertük meg és aktivitásának mérésére igen érzékeny módszert dolgoztunk ki, szükséges a sejtek elhalását megelőző sejtéréshez is. Az idegrendszerben az eltakarító mechanizmusok zavara eredményeink szerint transzglutamináz által keresztkötött fehérje zárványok felszaporodáshoz vezet; meghatároztuk hogy milyen fehérjék mely oldalláncai vannak ilyenkor keresztkötve. Az általunk kifejlesztett apopto-fagocita Tachman Low Density Array segítségével párhuzamosan mérni lehet hogy az eltakarító folyamatban szerepet játszó gének kifejeződése hogyan van szabályozva; eredményeink azt mutatják, hogy az elhalt sejteket bekebelező fagociták különbséget tesznek a különböző módon elhalt sejtek között. | The effective removal of the many billions of cells dying in our body every day is necessary to prevent the development of inflammatory and autoimmune diseases. In our experiments several so far unknown elements of this clearance mechanism have been revealed. It has been determined that the protein crosslinking transglutaminase plays an important role in the regulation of this process and the lack of this enzyme leads to autoimmune reactions. The transglutaminase, of which we have found several novel substrates and developed a new activity assay, also plays an important role in the differentiation of cells preceeding their death. The dysregulation of the clearance mechanisms in the central nervous system leads to the accummulation of transglutaminase cross-linked protein aggregates; we have determined which proteins at which residue are crosslinked in these structures. A novel Tachman Low Density Array has been developed for the parallel measurement and study of the regulation of the expression level of those genes which play an important role in the clearance of apoptotic cells; our results show that the engulfing cells can differentiate among dying cells according to the way how their death occured

A harmadik szinapszis. Molekuláris kölcsönhatások az elhaló sejtek és az azokat eltávolító makrofágok, dendritikus sejtek között. = The third synapsis. Molecular interactions between dying cells and macrophages or dendritic cells.

A tudományos iskola keretében új interdiszciplináris kutatási terület megteremtésére került sor az apoptótikus sejtek és az azokat eltávolító sejtek közötti harmadi szinapszis tanulmányozására. Megállapítottuk, hogy a transzglutamináz 2 (TG2) enzim szerepet játszik az apoptotikus sejtek eltávolításában, az enzim hiányában autoimmun kórkép alakúl ki. A TG2 bejuthat a sejmagba, sejtbiokémiai hatása összefügg génkifejeződés befolyásolásával. Alzheimer kórban a TG2 résztvesz kovalensen összekötött fehérje aggregátumok létrehozásában. A TG2 védőhatást fejt ki a sejtelhalással szemben májsejtekben és szívizomsejtekben G fehérje, ill. protein diszulfid izomeráz aktivitásával. A PPAR? szerepet játszik az apoptótikus sejteket eltávolító fagocitáló képesség kialakításában fokozva fagocitózis gének kifejeződését. A PPAR?, a retinoid receptor és az LXR receptor szignál utak összekapcsolódnak a makrofágok koleszterol szintjének szabályozásában. A PPAR? aktiváció hatására a dendritikus sejekből fokozott fagocitózisra, hatékony lipid prezentációra és iNKT aktivitásra képes alpopuláció alakul. Apopto-fagocita Taqman Low Density Array-t fejleszttünkl 94 gén mennyiségi kifejeződése vizsgálatára. Az autofágiával elhaló sejtek eltávolítása szintén fagocitózissal történik, specifikus gének indukálódnak. A dendritikus sejtek kölcsönhatása apoptótikus vagy nekrotikus sejtekkel alkalmas az immunválasz finom szabályozására. | In the supported Research School a new interdisciplinary research area has been developed to study the third synapse formed between apoptotic cells and those which engolfe them. It has been established that the transglutaminase 2 (TG2) enzyme plays an important role in the clearance of apoptotic cells, the lack of this enzyme leads to autoimmune disease. TG2 can enter the nucleus and its cell biochemical effects are related to modulation of gene expression and modification of the cytoskeleton. In Alzheimer's disease TG2 participates in the formation of covalently cross-linked protein aggregates. TG2 can protect hepatocytes and cardiomyocytes against apoptosis through its G protein and protein disulphide isomerase activities. PPARγ contributes to the development of phagocytic capacity of macrophages by inducing specific phagocytic genes. The PPARγ, rretinoid and LXR receptor signal pathways are interlinked in regulating cholesterol content of cells. Activation of PPARγ in dendritic cells leads to the development of a subpopulation with increased phagocytic capacity, effective lipid presentation and iNKT activity. An apopto-phagocytic Taqman Low Density array has been developed for quantitative measuring of 94 genes in parallel. Cells dying by autophagy are removed by the same mechanism as apoptotic cells while specific phagocytic genes are induced. Dendritic cells interacting with apoptotic cells can fine tune the immune system

Üzleti modellek a biotechnológiai iparban

Dolgozatom célja, hogy egyrészt globális szemszögből átfogó képet adjon a biotechnológiai iparról, annak technológiájáról, hajtóerőiről, pénzügyi teljesítményéről, más iparágakkal való interakcióiról, és a résztvevők kulcs sikertényezőiről és kockázatairól is.Mscvtv