Funktion und Expression gastrointestinal und hepatisch exprimierter Organic Anion Transporting Polypeptides (OATP)

It has been shown that drugs have to reach sufficient concentrations at the site of pharmacological action to be pharmacologically effective. Just a few years ago it was assumed that the physiochemical characteristics of a molecule alone are relevant for the ability of substances to cross cell membranes. Several studies in recent years have now demonstrated that specific transport proteins in plasma membranes are important for the uptake, distribution, and elimination of drugs. Such transport proteins mediate the transport of substances across membrane barriers or tissues. For a better understanding of the function of these transporters, the expression, localization, regulation, and function of these transporters is currently under intensive investigation. One important transporter family for cellular drug uptake is the OATP family (organic anion transporting polypeptides). In the first part of this thesis it was investigated, in which cells OATP2A1, formerly termed prostaglandin transporter (PGT), is expressed in the upper gastrointestinal tract. Furthermore, the potential impact of cyclooxygenase inhibitors on OATP2A1-mediated transport was investigated. Until today the relevance of this transporter for drug transport and for physiological and pathophysiological processes in the human gastrointestinal tract has hardly been discussed. In this study it could be demonstrated that OATP2A1 is expressed in the neck region and deep pyloric glands of the antrum and in parietal cells of the gastric corpus. Furthermore, it was shown that various cyclooxygenase inhibitors are also inhibitors or stimulators of the OATP2A1-mediated uptake. These results suggest that these effects may contribute to differences in the gastrointestinal side effects of cyclooxygenase inhibitors, such as ulcerations and bleedings. In the second part of this thesis the impact of flavonoids on the intestinal uptake of drugs mediated by OATP1A2 and OATP2B1 was investigated. Flavonoids represent the most abundant polyphenoles in vegetables, fruits, tea, wine, and juices. They are also constituents of various dietary supplements or herbal drugs. The impact of flavonoids on intestinal drug metabolizing enzymes and transporters is of special interest because the intraluminal concentrations of flavonoids such as apigenin, kaempferol, and quercetin can reach sufficient concentrations to modify the intestinal drug metabolism and transport. The presented data show that the flavonoids apigenin, kaempferol, and quercetin can inhibit the OATP1A2- and OATP2B1-mediated uptake of substrates into cells by a competitive mechanism. The inhibition of these transporters indicates that the modification of the transport activity may be a mechanism for food-drug or drug-drug interactions. In the third part of this thesis the role of conserved positively charged lysine and arginine amino acids in transmembrane helices for the OATP1B3-mediated uptake was investigated. Using site-directed mutagenesis, lysine and arginine residues were replaced by other amino acids to investigate their impact on OATP1B3 transport activity. Data of kinetic studies were supported by a structural modeling of OATP1B3. Here it was shown that the positive charges at positions 41 and 580 in OATP1B3 are important for transport activity of OATP1B3. In addition the structural modeling indicated that also the orientation of the amino acids lysine 41 and arginine 580 is important for the functional activity of the OATP1B3 uptake transporter. Taken together these in vitro-studies show the importance of organic anion transporting polypeptides for drug-drug interactions. These findings may contribute to a better understanding of drug absorption in the small intestine and the liver and of the prevention of side effects of drugs.Damit ein Arzneistoff wirken kann, muss er in einer ausreichenden Konzentration am Wirkort vorliegen. Bis vor einigen Jahren wurde angenommen, dass vor allem die physikochemischen Moleküleigenschaften die Permeabilität durch Membranen beeinflussen und die Substanzen überwiegend aufgrund passiver Diffusion in die Zellen gelangen. In den letzten Jahren wurde nun zunehmend die Bedeutung von Aufnahme- und Efflux-Transportproteinen für die Pharmakokinetik von Arzneistoffen erkannt. Mithilfe dieser Transporter können Substanzen Membranbarrieren überwinden oder Gewebe vor toxischen Substanzen geschützt werden. Eine wichtige Transportproteinfamilie für die intrazelluläre Aufnahme von Arzneistoffen bilden die Organic Anion Transporting Polypeptides (OATPs), von denen einige humane Vertreter in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Thema des ersten Teilprojekts dieser Arbeit war es, Erkenntnisse über die Lokalisation und Funktion des im Magen des Menschen exprimierten Prostaglandintransporters OATP2A1 zu erlangen. So war bisher lediglich bekannt, dass Cyclooxygenaseinhibitoren die PGE2-synthetisierenden Enzyme COX-1 und COX-2 hemmen und somit die zellulären PGE2-vermittelten Effekte modifizieren können. Möglicherweise können Cyclooxygenaseinhibitoren aber auch über die Hemmung des OATP2A1-vermittelten Transports, welcher wahrscheinlich für die Wiederaufnahme von PGE2 in die Zelle verantwortlich ist, die PGE2-vermittelten zellulären Effekte beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass OATP2A1 in der Schleimhaut des humanen Magens in den säureproduzierenden Magendrüsen lokalisiert ist. Des Weiteren konnte mittels einer OATP2A1-exprimierenden Zelllinie gezeigt werden, dass bestimmte Cyclooxygenaseinhibitoren den OATP2A1-vermittelten Transport inhibieren, andere aber auch stimulieren können. Zusätzlich zur Cyclooxygenasehemmung durch die NSAIDs ist diese Modifikation der Transportfunktion möglicherweise für die unterschiedliche Häufigkeit von gastrointestinalen Nebenwirkungen wie Ulzerationen und Blutungen verantwortlich. Das zweite Teilprojekt der Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss von Flavonoiden auf die intestinale Arzneistoffaufnahme durch die Hemmung der OATP-Transporter OATP1A2 und OATP2B1. Flavonoide zählen neben den Anthocyanen zu den am häufigsten vorkommenden Polyphenolen in Lebensmitteln. Sie sind ebenso Bestandteile zahlreicher Nahrungsergänzungsmittel und pflanzlicher Arzneimittel. Der Einfluss von Flavonoiden auf intestinale arzneistoffmetabolisierende Enzyme und Arzneistofftransporter spielt möglicherweise eine große Rolle, da die intraluminale Flavonoid-Konzentration von z.B. Apigenin, Kaempferol und Quercetin im Darm ausreichend hoch sein kann, um den intestinalen Arzneistoffmetabolismus und -transport im Darm zu beeinflussen. Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Flavonoide Apigenin, Kaempferol und Quercetin, die alle Bestandteile verschiedener Nahrungsmittel und Nahrungsergänzungsmittel (z.B. Ginkgo biloba-Zubereitungen) sind, den OATP1A2- und OATP2B1-vermittelten Transport von Substraten in die Zelle durch einen kompetitiven Mechanismus inhibieren können. Das weist darauf hin, dass Lebensmittel und pflanzliche Arzneimittel, die diese Flavonoide enthalten, für Lebensmittel- oder Arzneimittelinteraktionen verantwortlich sein könnten. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss konservierte positiv-geladene Lysin- und Arginin-Reste in Transmembranhelices auf die Transportaktivität des hepatisch exprimierten Aufnahmetransporters OATP1B3 haben. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden in der humanen OATP-Familie konserviert vorkommende, positiv-geladene Aminosäuren ausgetauscht und die Veränderungen in der Transportaktivität von OATP1B3 untersucht. Die transportkinetischen Daten wurden durch eine strukturelle Modellierung des OATP1B3-Proteins unterstützt. Dabei zeigte sich, dass die positiven Ladungen an den Positionen 41 und 580 wichtig für den Transport von Substraten durch OATP1B3 sind. Jedoch zeigte sich durch die strukturelle Modellierung auch, dass ebenso wie die Ladung auch die Orientierung der Aminosäuren Lysin 41 und Arginin 580 eine wichtige Rolle für die funktionelle Transportaktivität des OATP1B3-Aufnahmetransporters spielt. Insgesamt belegen diese in vitro-Arbeiten die Bedeutung der Aufnahme-Transportproteine der OATP-Familie für Arzneimittel-Wechselwirkungen. Diese Erkenntnisse können zum Verständnis über die Resorption von Arzneimitteln im Dünndarm und in der Leber und zur Vermeidung von Nebenwirkungen von Arzneimitteln beitragen

Prostaglandin E2 stimulates the epithelial sodium channel (ENaC) in cultured mouse cortical collecting duct cells in an autocrine manner

Funding: This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), project number 387509280, SFB 1350), the Alexander von Humboldt Foundation (3.3-GRO/1143730 STP), the Interdisziplin ̈ares Zentrum für KlinischeForschung of Friedrich-Alexander University (IZKF, TP-A33), and the Bayerische Forschungsstiftung (PDOK-74-10).Prostaglandin E2 (PGE2) is the most abundant prostanoid in the kidney, affecting a wide range of renal functions. Conflicting data have been reported regarding the effects of PGE2 on tubular water and ion transport. The amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC) is rate limiting for transepithelial sodium transport in the aldosterone-sensitive distal nephron. The aim of the present study was to explore a potential role of PGE2 in regulating ENaC in cortical collecting duct (CCD) cells. Short-circuit current (ISC) measurements were performed using the murine mCCDcl1 cell line known to express characteristic properties of CCD principal cells and to be responsive to physiological concentrations of aldosterone and vasopressin. PGE2 stimulated amiloride-sensitive ISC via basolateral prostaglandin E receptors type 4 (EP4) with an EC50 of ∼7.1 nM. The rapid stimulatory effect of PGE2 on ISC resembled that of vasopressin. A maximum response was reached within minutes, coinciding with an increased abundance of β-ENaC at the apical plasma membrane and elevated cytosolic cAMP levels. The effects of PGE2 and vasopressin were nonadditive, indicating similar signaling cascades. Exposing mCCDcl1 cells to aldosterone caused a much slower (∼2 h) increase of the amiloride-sensitive ISC. Interestingly, the rapid effect of PGE2 was preserved even after aldosterone stimulation. Furthermore, application of arachidonic acid also increased the amiloride-sensitive ISC involving basolateral EP4 receptors. Exposure to arachidonic acid resulted in elevated PGE2 in the basolateral medium in a cyclooxygenase 1 (COX-1)-dependent manner. These data suggest that in the cortical collecting duct, locally produced and secreted PGE2 can stimulate ENaC-mediated transepithelial sodium transport.Publisher PDFPeer reviewe

Function and Expression of gastrointestinal and hepatic Organic Anion Transporting Polypeptides (OATP)

Damit ein Arzneistoff wirken kann, muss er in einer ausreichenden Konzentration am Wirkort vorliegen. Bis vor einigen Jahren wurde angenommen, dass vor allem die physikochemischen Moleküleigenschaften die Permeabilität durch Membranen beeinflussen und die Substanzen überwiegend aufgrund passiver Diffusion in die Zellen gelangen. In den letzten Jahren wurde nun zunehmend die Bedeutung von Aufnahme- und Efflux-Transportproteinen für die Pharmakokinetik von Arzneistoffen erkannt. Mithilfe dieser Transporter können Substanzen Membranbarrieren überwinden oder Gewebe vor toxischen Substanzen geschützt werden. Eine wichtige Transportproteinfamilie für die intrazelluläre Aufnahme von Arzneistoffen bilden die Organic Anion Transporting Polypeptides (OATPs), von denen einige humane Vertreter in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Thema des ersten Teilprojekts dieser Arbeit war es, Erkenntnisse über die Lokalisation und Funktion des im Magen des Menschen exprimierten Prostaglandintransporters OATP2A1 zu erlangen. So war bisher lediglich bekannt, dass Cyclooxygenaseinhibitoren die PGE2-synthetisierenden Enzyme COX-1 und COX-2 hemmen und somit die zellulären PGE2-vermittelten Effekte modifizieren können. Möglicherweise können Cyclooxygenaseinhibitoren aber auch über die Hemmung des OATP2A1-vermittelten Transports, welcher wahrscheinlich für die Wiederaufnahme von PGE2 in die Zelle verantwortlich ist, die PGE2-vermittelten zellulären Effekte beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass OATP2A1 in der Schleimhaut des humanen Magens in den säureproduzierenden Magendrüsen lokalisiert ist. Des Weiteren konnte mittels einer OATP2A1-exprimierenden Zelllinie gezeigt werden, dass bestimmte Cyclooxygenaseinhibitoren den OATP2A1-vermittelten Transport inhibieren, andere aber auch stimulieren können. Zusätzlich zur Cyclooxygenasehemmung durch die NSAIDs ist diese Modifikation der Transportfunktion möglicherweise für die unterschiedliche Häufigkeit von gastrointestinalen Nebenwirkungen wie Ulzerationen und Blutungen verantwortlich. Das zweite Teilprojekt der Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss von Flavonoiden auf die intestinale Arzneistoffaufnahme durch die Hemmung der OATP-Transporter OATP1A2 und OATP2B1. Flavonoide zählen neben den Anthocyanen zu den am häufigsten vorkommenden Polyphenolen in Lebensmitteln. Sie sind ebenso Bestandteile zahlreicher Nahrungsergänzungsmittel und pflanzlicher Arzneimittel. Der Einfluss von Flavonoiden auf intestinale arzneistoffmetabolisierende Enzyme und Arzneistofftransporter spielt möglicherweise eine große Rolle, da die intraluminale Flavonoid-Konzentration von z.B. Apigenin, Kaempferol und Quercetin im Darm ausreichend hoch sein kann, um den intestinalen Arzneistoffmetabolismus und -transport im Darm zu beeinflussen. Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Flavonoide Apigenin, Kaempferol und Quercetin, die alle Bestandteile verschiedener Nahrungsmittel und Nahrungsergänzungsmittel (z.B. Ginkgo biloba-Zubereitungen) sind, den OATP1A2- und OATP2B1-vermittelten Transport von Substraten in die Zelle durch einen kompetitiven Mechanismus inhibieren können. Das weist darauf hin, dass Lebensmittel und pflanzliche Arzneimittel, die diese Flavonoide enthalten, für Lebensmittel- oder Arzneimittelinteraktionen verantwortlich sein könnten. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss konservierte positiv-geladene Lysin- und Arginin-Reste in Transmembranhelices auf die Transportaktivität des hepatisch exprimierten Aufnahmetransporters OATP1B3 haben. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden in der humanen OATP-Familie konserviert vorkommende, positiv-geladene Aminosäuren ausgetauscht und die Veränderungen in der Transportaktivität von OATP1B3 untersucht. Die transportkinetischen Daten wurden durch eine strukturelle Modellierung des OATP1B3-Proteins unterstützt. Dabei zeigte sich, dass die positiven Ladungen an den Positionen 41 und 580 wichtig für den Transport von Substraten durch OATP1B3 sind. Jedoch zeigte sich durch die strukturelle Modellierung auch, dass ebenso wie die Ladung auch die Orientierung der Aminosäuren Lysin 41 und Arginin 580 eine wichtige Rolle für die funktionelle Transportaktivität des OATP1B3-Aufnahmetransporters spielt. Insgesamt belegen diese in vitro-Arbeiten die Bedeutung der Aufnahme-Transportproteine der OATP-Familie für Arzneimittel-Wechselwirkungen. Diese Erkenntnisse können zum Verständnis über die Resorption von Arzneimitteln im Dünndarm und in der Leber und zur Vermeidung von Nebenwirkungen von Arzneimitteln beitragen.It has been shown that drugs have to reach sufficient concentrations at the site of pharmacological action to be pharmacologically effective. Just a few years ago it was assumed that the physiochemical characteristics of a molecule alone are relevant for the ability of substances to cross cell membranes. Several studies in recent years have now demonstrated that specific transport proteins in plasma membranes are important for the uptake, distribution, and elimination of drugs. Such transport proteins mediate the transport of substances across membrane barriers or tissues. For a better understanding of the function of these transporters, the expression, localization, regulation, and function of these transporters is currently under intensive investigation. One important transporter family for cellular drug uptake is the OATP family (organic anion transporting polypeptides). In the first part of this thesis it was investigated, in which cells OATP2A1, formerly termed prostaglandin transporter (PGT), is expressed in the upper gastrointestinal tract. Furthermore, the potential impact of cyclooxygenase inhibitors on OATP2A1-mediated transport was investigated. Until today the relevance of this transporter for drug transport and for physiological and pathophysiological processes in the human gastrointestinal tract has hardly been discussed. In this study it could be demonstrated that OATP2A1 is expressed in the neck region and deep pyloric glands of the antrum and in parietal cells of the gastric corpus. Furthermore, it was shown that various cyclooxygenase inhibitors are also inhibitors or stimulators of the OATP2A1-mediated uptake. These results suggest that these effects may contribute to differences in the gastrointestinal side effects of cyclooxygenase inhibitors, such as ulcerations and bleedings. In the second part of this thesis the impact of flavonoids on the intestinal uptake of drugs mediated by OATP1A2 and OATP2B1 was investigated. Flavonoids represent the most abundant polyphenoles in vegetables, fruits, tea, wine, and juices. They are also constituents of various dietary supplements or herbal drugs. The impact of flavonoids on intestinal drug metabolizing enzymes and transporters is of special interest because the intraluminal concentrations of flavonoids such as apigenin, kaempferol, and quercetin can reach sufficient concentrations to modify the intestinal drug metabolism and transport. The presented data show that the flavonoids apigenin, kaempferol, and quercetin can inhibit the OATP1A2- and OATP2B1-mediated uptake of substrates into cells by a competitive mechanism. The inhibition of these transporters indicates that the modification of the transport activity may be a mechanism for food-drug or drug-drug interactions. In the third part of this thesis the role of conserved positively charged lysine and arginine amino acids in transmembrane helices for the OATP1B3-mediated uptake was investigated. Using site-directed mutagenesis, lysine and arginine residues were replaced by other amino acids to investigate their impact on OATP1B3 transport activity. Data of kinetic studies were supported by a structural modeling of OATP1B3. Here it was shown that the positive charges at positions 41 and 580 in OATP1B3 are important for transport activity of OATP1B3. In addition the structural modeling indicated that also the orientation of the amino acids lysine 41 and arginine 580 is important for the functional activity of the OATP1B3 uptake transporter. Taken together these in vitro-studies show the importance of organic anion transporting polypeptides for drug-drug interactions. These findings may contribute to a better understanding of drug absorption in the small intestine and the liver and of the prevention of side effects of drugs

Interplay between the prostaglandin transporter OATP2A1 and prostaglandin E2-mediated cellular effects.

Prostaglandins such as prostaglandin E2 (PGE2) play a pivotal role in physiological and pathophysiological pathways in gastric mucosa. Little is known about the interrelation of the prostaglandin E (EP) receptors with the prostaglandin transporter OATP2A1 in the gastric mucosa and gastric carcinoma. Therefore, we first investigated the expression of OATP2A1 and EP4 in normal and carcinoma gastric mucosa. Different PGE2-mediated cellular pathways and mechanisms were investigated using human embryonic kidney cells (HEK293) and the human gastric carcinoma cell line AGS stably transfected with OATP2A1. Colocalization and expression of OATP2A1 and EP4 were detected in mucosa of normal gastric tissue and of gastric carcinomas. OATP2A1 reduced the PGE2-mediated cAMP production in HEK293 and AGS cells overexpressing EP4 and OATP2A1. The expression of OATP2A1 in AGS cells resulted in a reduction of [(3)H]-thymidine incorporation which was in line with a higher accumulation of AGS-OATP2A1 cells in S-phase of the cell cycle compared to control cells. In contrast, the expression of OATP2A1 in HEK293 cells had no influence on the distribution in the S-phase compared to control cells. OATP2A1 also diminished the PGE2-mediated expression of interleukin-8 mRNA (IL-8) and hypoxia-inducible-factor 1α (HIF1α) protein in AGS-OATP2A1 cells. The expression of OATP2A1 increased the sensitivity of AGS cells against irinotecan which led to reduced cell viability. Taken together, these data show that OATP2A1 influences PGE2-mediated cellular pathways. Therefore, OATP2A1 needs to be considered as a key determinant for the understanding of the physiology and pathophysiology of prostaglandins in healthy and tumorous gastric mucosa

Prostaglandin E₂ stimulates the epithelial sodium channel (ENaC) in cultured mouse cortical collecting duct cells in an autocrine manner

Prostaglandin E2 (PGE2) is the most abundant prostanoid in the kidney, affecting a wide range of renal functions. Conflicting data have been reported regarding the effects of PGE2 on tubular water and ion transport. The amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC) is rate limiting for transepithelial sodium transport in the aldosterone-sensitive distal nephron. The aim of the present study was to explore a potential role of PGE2 in regulating ENaC in cortical collecting duct (CCD) cells. Short-circuit current (ISC) measurements were performed using the murine mCCDcl1 cell line known to express characteristic properties of CCD principal cells and to be responsive to physiological concentrations of aldosterone and vasopressin. PGE2 stimulated amiloride-sensitive ISC via basolateral prostaglandin E receptors type 4 (EP4) with an EC50 of ∼7.1 nM. The rapid stimulatory effect of PGE2 on ISC resembled that of vasopressin. A maximum response was reached within minutes, coinciding with an increased abundance of β-ENaC at the apical plasma membrane and elevated cytosolic cAMP levels. The effects of PGE2 and vasopressin were nonadditive, indicating similar signaling cascades. Exposing mCCDcl1 cells to aldosterone caused a much slower (∼2 h) increase of the amiloride-sensitive ISC. Interestingly, the rapid effect of PGE2 was preserved even after aldosterone stimulation. Furthermore, application of arachidonic acid also increased the amiloride-sensitive ISC involving basolateral EP4 receptors. Exposure to arachidonic acid resulted in elevated PGE2 in the basolateral medium in a cyclooxygenase 1 (COX-1)-dependent manner. These data suggest that in the cortical collecting duct, locally produced and secreted PGE2 can stimulate ENaC-mediated transepithelial sodium transport