Elucidating the molecular basis of spindle assembly checkpoint signaling

The spindle assembly checkpoint (SAC) is a highly conserved eukaryotic surveillance mechanism that maintains genomic integrity by delaying mitotic progression until all chromosomes have become properly attached to the mitotic spindle via their kinetochores. Malfunction of this checkpoint leads to chromosome segregation errors and has been implicated in tumorigenesis. SAC protein localization to unattached kinetochores is considered to be required for checkpoint signaling. This study employs the model organism Schizosaccharomyces pombe to investigate the role of different checkpoint components and their interactions with each other during the SAC signaling cascade. We examined the link between Mad1 and Bub1 to explore the connection between upstream and downstream events during checkpoint signaling. We found that conserved motifs in Bub1 and Mad1 are essential for Mad1 localization to the kinetochore and checkpoint activity. Furthermore, we revealed a hitherto unknown additional function of Mad1 in creating the checkpoint signal. Bub1 seems to act upstream of Mad1, and certain motifs in one of the kinetochore proteins are required for kinetochore recruitment of the Bub3-Bub1 complex. Here we provide evidence that a subset of these motifs is sufficient for this recruitment and checkpoint activity. The ultimate effector of checkpoint signaling is the mitotic checkpoint complex. It was recently found that the composition of this complex is different from previously assumed. While early work suggested the presence of one Cdc20 molecule in the complex, latest results revealed that the mitotic checkpoint complex actually contains two Cdc20 molecules when bound to the APC/C. We observed the same situation in fission yeast and describe the role of conserved motifs within the checkpoint protein Mad3 in binding to those Cdc20 molecules. We furthermore indicate a function of the APC/C subunit Apc15 in the checkpoint that was unexpected based on work in other model organisms. Taken together, we added new facets to the picture of spindle assembly checkpoint signaling and highlight similarities and differences between organisms, which illustrate how conserved, yet versatile this signaling pathway is.Der „spindle assembly checkpoint“ (SAC) ist ein hoch konservierter, eukaryontischer Überwachungsmechanismus der die genomische Integrität aufrechterhält, indem er das Fortschreiten der Mitose so lange verhindert, bis die Mikrotubuli der mitotischen Spindel sich an alle Kinetochore angeheftet haben. Eine Fehlfunktion dieses Kontrollmechanismus führt zu Fehlern bei der Chromosomensegregation und kann zur Tumorentstehung beitragen. SAC-Proteine konzentrieren sich an unangehefteten Kinetochoren, was als Voraussetzung für die Entstehung des SAC-Signals gilt. Diese Studie verwendet den Modellorganismus Schizosaccharomyces pombe um die Rolle der einzelnen SAC-Proteine und deren Interaktionen während der SACSignalkaskade aufzudecken. Wir haben die Verbindung zwischen Mad1 und Bub1 untersucht, um die Verknüpfung zwischen frühen und späteren Vorgängen des SACSignalwegs zu verstehen. Dabei haben wir herausgefunden, dass konservierte Motive in Bub1 und Mad1 essentiell sind, um Mad1 an Kinetochore zu rekrutieren und ein SAC-Signal zu generieren. Zudem haben wir gezeigt, dass Mad1 eine zusätzliche und bisher unbekannte Funktion im SAC hat. Bub1 spielt früher als Mad1 eine Rolle in der SAC-Signalkaskade und bestimmte Motive in einem der Kinetochorproteine werden für die Rekrutierung des Bub3-Bub1 Komplexes an die Kinetochore benötigt. Wir zeigen, dass ein kleiner Teil dieser Motive bereits für die Rekrutierung und die Aktivität des Checkpoints ausreicht. Der letztendliche Effektor des Checkpoint-Signals ist der „mitotische Checkpoint Komplex“. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Zusammensetzung dieses Komplexes von bisherigen Annahmen abweicht. Während frühere Arbeiten darauf hinwiesen, dass ein Molekül des Cdc20 Proteins Teil des Komplexes ist, haben neueste Ergebnisse gezeigt, dass der Komplex tatsächlich zwei Cdc20 Moleküle enthält, wenn er an den APC/C gebunden ist. Wir beobachteten eine vergleichbare Situation in Spalthefe und beschreiben wie konservierte Motive im Checkpoint Protein Mad3 zur Bindung dieser Cdc20 Moleküle beitragen. Zudem zeigen wir, dass die APC/C Untereinheit Apc15 in S. pombe für Checkpoint-Aktivität benötigt wird, was basierend auf Arbeiten in anderen Organismen unerwartet war. Zusammenfassend konnten wir neue Aspekte des „spindle assembly checkpoint“ Signalwegs aufzeigen und haben sowohl Übereinstimmungen als auch Unterschiede zwischen Organismen gefunden, was verdeutlicht wie konserviert aber zugleich wandlungsfähig dieser Signalweg ist

Bub3-Bub1 binding to Spc7/KNL1 toggles the spindle checkpoint switch by licensing the interaction of Bub1 with Mad1-Mad2

The spindle assembly checkpoint (SAC) ensures that sister chromatids do not separate until all chromosomes are attached to spindle microtubules and bi-oriented. Spindle checkpoint proteins, including Mad1, Mad2, Mad3 (BubR1), Bub1, Bub3, and Mph1 (Mps1), are recruited to unattached and/or tensionless kinetochores. SAC activation catalyzes the conversion of soluble Mad2 (O-Mad2) into a form (C-Mad2) that binds Cdc20, BubR1, and Bub3 to form the mitotic checkpoint complex (MCC), a potent inhibitor of the anaphase-promoting complex (APC/C). SAC silencing de-represses Cdc20-APC/C activity allowing poly-ubiquitination of Securin and Cyclin B, leading to the dissolution of sister chromatids and anaphase onset [1]. Understanding how microtubule interaction at kinetochores influences the timing of anaphase requires an understanding of how spindle checkpoint protein interaction with the kinetochore influences spindle checkpoint signaling. We, and others, recently showed that Mph1 (Mps1) phosphorylates multiple conserved MELT motifs in the Spc7 (Spc105/KNL1) protein to recruit Bub1, Bub3, and Mad3 (BubR1) to kinetochores [2-4]. In budding yeast, Mps1 phosphorylation of a central non-catalytic region of Bub1 promotes its association with the Mad1-Mad2 complex, although this association has not yet been detected in other organisms [5]. Here we report that multisite binding of Bub3 to the Spc7 MELT array toggles the spindle checkpoint switch by permitting Mph1 (Mps1)-dependent interaction of Bub1 with Mad1-Mad2

Mad1 contribution to spindle assembly checkpoint signalling goes beyond presenting Mad2 at kinetochores

The spindle assembly checkpoint inhibits anaphase until all chromosomes have become attached to the mitotic spindle. A complex between the checkpoint proteins Mad1 and Mad2 provides a platform for Mad2:Mad2 dimerization at unattached kinetochores, which enables Mad2 to delay anaphase. Here, we show that mutations in Bub1 and within the Mad1 C-terminal domain impair the kinetochore localization of Mad1:Mad2 and abrogate checkpoint activity. Artificial kinetochore recruitment of Mad1 in these mutants co-recruits Mad2; however, the checkpoint remains non-functional. We identify specific mutations within the C-terminal head of Mad1 that impair checkpoint activity without affecting the kinetochore localization of Bub1, Mad1 or Mad2. Hence, Mad1 potentially in conjunction with Bub1 has a crucial role in checkpoint signalling in addition to presenting Mad2