10 research outputs found
Tobacco Smoke Exposure During Pregnancy Increases Maternal Blood Lead Levels Affecting Neonate Birth Weight
To assess the effect of lead exposure from cigarette smoke on fetal growth, blood lead concentrations were measured using inductively coupled plasma mass spectrometry in 150 healthy pregnant women. Mean lead concentrations in plasma and whole blood were significantly higher in the smoking group compared with the nonsmoking group in each trimester of pregnancy (p < 0.001). Logistic regression analysis showed the highest impact of the number of cigarettes smoked per day for serum lead concentration (β = 0.238; p < 0.05), while in whole blood, it was duration of smoking before conception (β = 0.297; p < 0.001). Birth weight of the smoking mothers' infants was significantly lower (mean ± SEM, 3,192 ± 50.8 and 3,569 ± 49.6 g, respectively; p < 0.001) and negatively correlated with lead levels in plasma (r = −0.38; p < 0.001) and in whole blood (r = −0.27; p < 0.001). Therefore, it is suggested that smoking during pregnancy increases lead concentrations in maternal blood. Fetal exposure to low doses of lead in utero may be a serious risk factor causing lower birth weight
Two novel C-terminal frameshift mutations in the β-globin gene lead to rapid mRNA decay
BACKGROUND:
The thalassemia syndromes are classified according to the globin chain or chains whose production is affected. β-thalassemias are caused by point mutations or, more rarely, deletions or insertions of a few nucleotides in the β-globin gene or its immediate flanking sequences. These mutations interfere with the gene function either at the transcriptional, translational or posttranslational level.
METHODS:
Two cases of Polish patients with hereditary hemolytic anemia suspected of thalassemia were studied. DNA sequencing and mRNA quantification were performed. Stable human cell lines which express wild-type HBB and mutated versions were used to verify that detected mutation are responsible for mRNA degradation.
RESULTS:
We identified two different frameshift mutations positioned in the third exon of HBB. Both patients harboring these mutations present the clinical phenotype of thalassemia intermedia and showed dominant pattern of inheritance. In both cases the mutations do not generate premature stop codon. Instead, slightly longer protein with unnatural C-terminus could be produced. Interestingly, although detected mutations are not expected to induce NMD, the mutant version of mRNA is not detectable. Restoring of the open reading frame brought back the RNA to that of the wild-type level.
CONCLUSION:
Our results show that a lack of natural stop codon due to the frameshift in exon 3 of β-globin gene causes rapid degradation of its mRNA and indicate existence of novel surveillance pathway
Neurochemical and Behavioral Characteristics of Toxic Milk Mice: An Animal Model of Wilson’s Disease
Development of the specific spectral methods towards searching new markers of selected diseases in clinical samples
Wyniki pomiarów chemicznych są wykorzystywane w wielu obszarach, między innymi: w przemyśle, przy ocenie składu surowców, półproduktów i produktów czy w kontroli zanieczyszczeń środowiska. Analiza chemiczna jest również doskonałym narzędziem wspomagającym poszukiwania surowców geologicznych, badania materiałów związanych
z rozwojem atomistyki czy badania związane z dziedzictwem kulturowym. Warto podkreślić, że ogromny rozwój technik pomiarowych w dziedzinie analizy chemicznej jaki nastąpił
w XX wieku, przyczynił się do dużego zainteresowania ich zastosowaniem w badaniach medycznych. Z jednej strony jest to związane z ulepszeniem rutynowych testów pozwalających na ocenę stanu zdrowia człowieka, ale również z rozwojem badań ukierunkowanych
na poszukiwanie nowych wskaźników stanów chorobowych. Pomiary chemiczne mają również zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, zarówno przy rutynowej kontroli jakości produkcji, jak również w badaniach związanych z opracowywaniem nowych leków
i sposobów ich wytwarzania. Niewątpliwie, rozwój nowych technik pomiarowych
i wyposażenie przyrządów w komputerowe systemy do ich obsługi, pozwalają na usprawnienie procedur pomiarowych. Warto przy tym podkreślić, że wbrew mylnemu często przekonaniu,
że automatyzacja rozwiązuje wszelkie problemy, to uzyskiwanie miarodajnych wyników
oraz ich właściwa interpretacja wymagają dużej wiedzy, doświadczenia oraz współpracy interdyscyplinarnej. Niewątpliwie chemik analityk musi posiadać umiejętność obsługi najnowocześniejszych urządzeń pomiarowych, ale przede wszystkim rozumieć procesy fizyko-chemiczne zachodzące podczas pomiaru, aby móc w sposób wiarygodny określić potencjalne źródła błędów. Dodatkowo, aby właściwie wybrać procedurę pomiarową, musi znać cel badań i mieć pełną świadomość każdego etapu prowadzonych badań.
Badania poświęcone kontroli stanu zdrowia człowieka warunkują potrzebę oznaczania stężenia pierwiastków na poziomie śladowym, co jest możliwe tylko dzięki wykorzystaniu bardzo precyzyjnych i czułych urządzeń pomiarowych. Poznanie poziomu na jakim wstępują pierwiastki w organizmie ludzkim czy ich rozmieszczenia w tkankach oraz poznanie procesów biochemicznych występujących w organizmie żywym wyznaczają kierunek rozwoju współczesnej chemii analitycznej, w tym analizy klinicznej.
W rozprawie doktorskiej została przedstawiona istota szeroko rozumianych badań interdyscyplinarnych poprzez przedstawienie trzech różnych historii, trzech różnych problemów i trzech różnych podejść chemika analityka, które pozwoliły odpowiedzieć na część pytań z zakresu medycyny i tym samym przyczynić się do lepszego poznania wybranych jednostek chorobowych czy zaburzeń organizmu.
W części literaturowej niniejszej pracy przedstawione zostały zagadnienia dotyczące analizy klinicznej oraz przybliżona została charakterystyka analityczna procedur pomiarowych.
W pierwszej części opisane zostały zarówno rutynowo stosowane metody diagnostyczne
jak i najczęściej wykorzystywane do tych celów próbki kliniczne. Przedstawiono również jakie najważniejsze informacje dotyczące stanu zdrowia można otrzymać poprzez sprawdzenie wybranych parametrów krwi i moczu, podkreślając tym samym znaczenie rutynowych badań diagnostycznych. Przedstawiono także alternatywne próbki kliniczne wraz z informacjami, jakie można uzyskać poprzez ich analizę. Opisano również badania próbek klinicznych, które nie są stosowane rutynowo w laboratoriach klinicznych, jednak mogą dostarczać wielu informacji i stać się cennym narzędziem diagnostycznym w dziedzinie medycyny. Ostatnim poruszanym tematem była charakterystyka analityczna procedur i metod pomiarowych,
w której przybliżono schemat postępowania analitycznego prowadzącego do uzyskania
jak najbardziej rzetelnych, wiarygodnych i użytecznych wyników.
W pracy eksperymentalnej opisano trzy projekty interdyscyplinarne, których głównym celem było stworzenie indywidualnych procedur analitycznych mających na celu znalezienie specyficznych wskaźników wybranych jednostek chorobowych w próbkach klinicznych
Każdy ze zrealizowanych projektów zaczyna się krótkim wprowadzeniem i ogólnym przedstawieniem problemu. Zabieg ten miał na celu przybliżenie, jakie informacje przed przystąpieniem do realizacji projektu należało uzyskać z prowadzonych badań interdyscyplinarnych z lekarzami i naukowcami. Sprecyzowanie celu analitycznego pozwoliło na dobór odpowiedniej procedury analitycznej, takiej aby uzyskane wyniki były przydatne.
Pierwszy projekt dotyczył stworzenia procedury oznaczania całkowitej zawartości ołowiu
w próbkach krwi i osocza, która byłaby szybka oraz względnie tania z powodu możliwości analizy dużej liczby próbek. Dodatkowo procedura musiała uwzględniać nie tylko małe ilości próbek przeznaczonych do badań, ale również musiała być bardzo czuła ze względu na niskie stężenia oznaczanego pierwiastka w próbkach. Utrudnieniem była bardzo mała ilość dostarczonych do badań próbek. Prowadzone pomiary były etapem dużego projektu,
w którym sprawdzano wpływ palenia papierosów na poziom ołowiu we krwi i w osoczu. Badaną grupą były kobiety w ciąży, które paliły papierosy przez cały okres trwania ciąży.
Grupę kontrolną stanowiły ciężarne kobiety niepalące. Poziom pierwiastka sprawdzany
był we wszystkich trymestrach ciąży. Otrzymane wyniki pozwoliły odpowiedzieć na pytanie, czy istnieje korelacja pomiędzy zawartością ołowiu we krwi i w osoczu, a liczbą wypalanych dziennie papierosów i niską masą urodzeniową dziecka. Badania te miały na celu potwierdzenie negatywnego wpływu nadmiernej ekspozycji na ołów na rozwój prenatalny. Badania były prowadzone przy ścisłej współpracy z Instytutem Matki i Dziecka w Warszawie.
Drugi projekt był częścią interdyscyplinarnych badań dotyczących rzadkiej choroby Wilsona. Celem prowadzonych badań w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej było opracowanie odpowiedniej procedury analitycznej pozwalającej na otrzymanie wiarygodnych wyników dotyczących zawartości miedzi, żelaza, cynku i manganu w tkankach pochodzących
z wybranych rejonów mózgu osób chorych na chorobę Wilsona. Największa trudność
przy opracowaniu procedury spowodowana była niewielkimi rozmiarami próbek,
co uniemożliwiało na przykład mineralizację wspomaganą promieniowaniem mikrofalowym w systemie zamkniętym, którą zwykle stosuje się w przypadku rozkładu próbek biologicznych w tym klinicznych. Dodatkową trudnością brak dostępnego komercyjnie materiału odniesienia, którego matryca byłaby idealnie spójna z badaną. Badania były prowadzone przy współpracy z Instytutem Instytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie.
Celem ostatniego projektu było opracowanie procedury pozwalającej na określenie rozmieszczenia wybranych pierwiastków (Mg, Cu, Zn, Mn, Fe) w tkankach jajników ludzkich. Taka procedura pozwoliłaby odpowiedzieć na pytanie, czy istnieją zależności pomiędzy rozmieszczeniem wybranych pierwiastków w próbce pochodzącej od osoby zdrowej
oraz w próbce pobranej od osoby u której stwierdzono obecność zmian nowotworowych
i tym samym wzbogacić dotychczasową wiedzę na temat nowotworów jajnika. Największą trudność w opracowywaniu procedury analitycznej był dobór optymalnych warunków,
w których prowadzona była ablacja laserowa, ze względu na złożoną i niejednorodną matrycę próbek i brak komercyjnie dostępnych materiałów odniesienia. Po optymalizacji procedury podjęto próbę znalezienia ewentualnych różnic i korelacji pomiędzy rozmieszczeniem wybranych pierwiastków w tkankach zdrowych i objętych choroba nowotworową. Badania prowadzone były przy współpracy z Wojskowym Instytutem Medycznym w Warszawie.
Niniejsza praca miała na celu pokazanie możliwości wykorzystania technik analitycznych
do rozwiązywania problemów i odpowiedzi na pytania z zakresu medycyny, stworzenie procedur dedykowanych konkretnym badaniom, próbkom i problemom. Poprzez opisanie trzech różnych historii chciałam dodatkowo podkreślić jak duży wpływ na rozwój współczesnej medycyny mogą mieć badania interdyscyplinarne, jak ważna jest ścisła współpraca z innymi jednostkami i instytucjami oraz jak istotne jest indywidualne podejście do badań z pogranicza nauk.
Rezultaty badań przedstawione w rozprawie doktorskiej zostały opublikowane w postaci sześciu publikacji oryginalnych
1. Dusek P., Bahn E., Litwin T., Jabłonka-Salach K., Łuciuk A., Huelnhagen T., Madai V.I., Dieringer M., Knauth M., Niendorf T., Sobesky J., Paul F., Schneider S.A., Czlonkowska A., Brück W., Wegner C., Wuerfel J., „Brain iron accumulation in Wilson disease: a post-mortem 7 Tesla MRI - histopathological study”, Annals of Neurology – w druku
2. Walter U., Skowrońska M., Litwin T., Szpak G.M., Jabłonka-Salach K., Skoloudík D., Bulska E., Członkowska A., „Lenticular nucleus hyperechogenicity in Wilson’s disease reflects local copper but not iron accumulation”, Journal of Neural Transmission, 121 (2014) 1273-1279
3. Chełchowska M., Ambroszkiewicz J., Jabłonka-Salach K., Gajewska J., Maciejewski T.M., Bulska E., Laskowska-Klita T., Leibschang J., „Tobacco smoke exposure during pregnancy increases maternal blood lead levels affecting neonate birth weight”, Biol. Trace. Elem. Res., 155 (2013) 169-175;
4. Przybyłkowski A., Gromadzka G., Wawer A., Bulska E., Jabłonka-Salach K., Grygorowicz T., Schnejder-Pachołek A., Członkowski A., „Neurochemical and Behavioral Characteristics of Toxic Milk Mice: An Animal Model of Wilson's Disease”, Neurochem Res, 38 (2013) 2037-2045
5. Litwin T., Gromadzka G., Szpak G.M., Jabłonka-Salach K., Bulska E., Członkowska A., „Brain metal accumulation in Wilson's disease”, Journal of the Neurological Sciences, 329 (2013) 55-58;
6. Chełchowska M., Jabłonka-Salach K., Ambroszkiewicz J., Maciejewski T., Gajewska J., Bulska E., Laskowska-Kalita T., Leibschang J., Barciszewski J., „Wpływ palenia tytoniu na poziom ołowiu we krwi kobiet ciężarnych”, Medycyna Wieku Rozwojowego,
3 (2012) 196-204The aim of this work was to elaborate specific analytical procedures supporting
the evaluation of novel disease’s markers.
In the frame of human health control there is a need to monitor trace elements occurrence, which is possible only though the use of very precise and sensitive methods. In this work the possibilities of using the facilities of modern analytical instrumentation towards obtaining medically relevant information was described. Especially, the specific analytical procedures tailored with respect of fit for purposes approach was used in order to overcome the difficulties with sample preparation and calibration. In the work three study-cases were elaborated, as to demonstrate various kinds of problems arising whenever interdisciplinary research is conducted, here in the field of contemporary medicine. Furthermore, to illustrate how important close cooperation between other units and institutions is as well as to stress the significance of individual interdisciplinary approach.
The first part of research was focused on the development of massive procedure enabling the determining of the content of lead in blood and plasma samples, which should be inexpensive (because of the large number of samples), relatively fast
and sensitive (because of low level of lead in those samples). One should be also aware of the small quantity of the aliquot available for conducting measurements.
The necessity to develop the reliable and fast screening procedure was part of a large project aiming to evaluate the influence of cigarette smoking on the content of lead
in whole blood and plasma of selected group of patients. The group examined were pregnant women who were active smokers throughout pregnancy. The control group consisted of pregnant but non-smoking women. The concentration of the element was monitored in all trimesters of pregnancy. The results obtained answer the question about the correlation between the level of lead in whole blood and plasma,
the number of cigarette smoked daily and the low weight of the newborn children.
The research was to confirm the negative influence of excessive exposition to lead
on the prenatal development. The research was carried out in cooperation with Mother and Child Institute in Warsaw.
The second area of research was part of interdisciplinary approach to investigate the reason of Wilson`s Disease. It aimed at answering the question whether,
and if so which, elements beside copper are responsible for the symptoms
and development of the disease. The objective of this dissertation was to elaborate
a non-routine novel analytical procedure which would allow us to receive reliable results on the concentration of copper, iron, zinc and manganese in the tissues from different parts of human brain; all originating from the patients with Wilson`s Disease. The biggest difficulty in working out the procedure resulted from small sample quantities. This made it impossible to apply? microwave digestion, which is commonly used in decomposing biological and clinical samples. Another difficulty was the lack
of commercially available reference material whose matrix would be ideally consistent with the sample examined. The research was carried out in cooperation with
the Institute Psychiatry and Neurology in Warsaw.
The aim of the third part of research was to elaborate and validate fully novel procedure which would allow mapping selected elements distribution over the tissues of human ovaries. It was expected that with such a procedure it would be possible
to evaluate the correlation between the distribution of selected elements over
the ovaries cross sections. Moreover, the comparison of the distribution maps between healthy human tissues and those from a person with cancer would broaden our knowledge on ovaries cancer. The biggest difficulty in establishing the analytical procedure was optimisation of conditions of laser ablation for ovaries tissues. It was due to the complex and heterogeneous sample matrix and the lack of commercially available reference material. After optimising the procedure an attempt was made towards finding the possible differences and correlation between heathy and cancerous tissues. The research was carried out in cooperation with Military Institute of Medicine in Warsaw
Modern diagnosis of thalassemia in children — own experience
Wstęp: Talasemie to grupa genetycznie uwarunkowanych niedokrwistości hemolitycznych,
spowodowanych ilościowym zaburzeniem syntezy łańcuchów globiny, zaliczana do grupy hemoglobinopatii
ilościowych. Niniejsza praca, jako jedna z niewielu w polskim piśmiennictwie,
zwraca uwagę na problem występowania talasemii w populacji dzieci polskich.
Celem pracy była ocena poszczególnych parametrów hematologicznych w rozpoznaniu różnicowym
niedokrwistości mikrocytowych u dzieci, określenie roli badań genetycznych w rozpoznawaniu
talasemii u dzieci oraz opracowanie optymalnego algorytmu postępowania diagnostycznego
przy podejrzeniu talasemii.
Materiał i metody: Badaniami objęto grupę 52 dzieci (31 chłopców i 21 dziewcząt) w wieku
od 1–15 lat bezskutecznie leczonych preparatami żelaza z powodu niedokrwistości mikrocytowej.
Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej WUM Nr 65/2007. Po analizie wywiadu
i podstawowych badań hematologicznych u wszystkich chorych wykonano elektroforezę hemoglobin,
oznaczenie poziomu HgbA2 i HgbF, w trzech przypadkach oznaczenie enzymów krwinek
czerwonych, w dwóch badanie w kierunku sferocytozy wrodzonej. Ponadto u wszystkich
pacjentów wykonano badania genetyczne w Zakładzie Genetyki PAN w Warszawie.
Wyniki: Spośród 52 dzieci objętych badaniem u 29 rozpoznano talasemię-b minor. U 28 wystarczające
okazały się rutynowe badania diagnostyczne oraz wykonanie elektroforezy hemoglobin
i oznaczenia stężeń HgbA2 i HgbF. U jednego pacjenta rozpoznanie ustalono po badaniu
genetycznym. U 6 dzieci dzięki badaniom genetycznym rozpoznano talasemię-a minor.
U 17 dzieci pomimo badań genetycznych nie udało się ustalić rozpoznania. U 6 z nich badanie
wykazało mutację promotora genu g globiny (Xmn1) odpowiedzialną za podwyższenie stężenia
HgbF. Badanie pozwoliło na stworzenie algorytmu postępowania diagnostycznego u chorych
na niedokrwistość mikrocytową.
Wnioski: Z uwagi na dużą liczbę fałszywie dodatnich i ujemnych wyników, wskaźniki matematyczne
nie wydają się mieć wielkiego znaczenia w diagnostyce mikrocytozy.
Erytrocytoza, mikrocytoza, obniżenie MCH przy prawidłowych parametrach gospodarki żelazem,
krwinki tarczowate w rozmazie są wskazaniem do przeprowadzenia diagnostyki w kierunku
talasemii-α, rzadszych postaci talasemii-β lub ich współwystępowania.
Rola badań genetycznych w diagnostyce talasemii a jest nieoceniona, choć nie zawsze daje
ostateczną odpowiedź.
J. Transf. Med. 2011; 3: 105–114Background: There has been a consensus that thalassemias are typical of the Mediterranean
region, North Africa, and Far and Middle Asia. However, recent progress in diagnostic
methods has led to the detection of thalassemia in Poland.
Routinely employed diagnostics often turn out insufficient to diagnose thalassemia, substantiating
the need to use modern molecular biological techniques.
This paper aimed at assessing the utility of some so far infrequently employed molecular
genetic tests for facilitating diagnosis of rare non-typical cases of thalassemia in Polish children.
Against this background, the significance of hematological parameters in the differential
diagnosis of microcytic anemias was evaluated. Based on the above, an attempt has been made
to establish an optimal algorithm for diagnosis of suspected thalassemia.
Material and methods: The study comprised a group of 52 children (31 boys and 21 girls) at
the age of 1–15 years, who were subjected to long-term treatment with iron preparation due to
microcytic anemia, with no subsequent improvement. A permission of the local Bioethical
Committee was obtained for this study.
After taking the history, basic hematologic tests were performed. The tests were then extended to
electrophoretic separation of hemoglobins, determination of HgbA2 and HgbF. In three cases
erythrocyte enzymes were tested, and in two examination towards hereditary spherocytosis was
carried out. Finally, genetic tests were performed.
Results: Of the 52 children examined, 29 cases were diagnosed as b-thalassemia minor.
Routine diagnostic tests (blood morphology, serum iron and ferritin, hemoglobin elctrophoresis,
HgbA2 and HgbF assay) were enough to ascertain diagnosis in 28 children. Diagnosis of
1 case was only possible on the basis of genetic tests.
Alpha-thalassemia minor was diagnosed in 6 children, and the diagnosis was only possible
due to genetic tests.
No diagnosis was ascertained in 17 children. Within this group, in 6 children only mutation
in the g globin gene promoter region (Xmn1) was held responsible for increased HgbF.
Conclusions: Considering numerous false positive and false negative results, mathematical
indexes as the initial screening in microcytic anemia seem not to have significant impact on
differential diagnosis. Genetic tests play essential role in diagnosing thalassemia although they
are not always effective. Changes such as erythrocytosis, microcytosis, hypochromy as well as
the presence of shield erythrocytes in peripheral blood smears indicating to do examinations.
We presented the practical diagnostic algorithm in microcytosis.
J. Transf. Med. 2011; 3: 105–11
Coexistence of Gilbert syndrome with hereditary haemolytic anaemias.
Genotyping of the UGT1A1 gene showed distinct distribution of the common A(TA)(n)TAA polymorphism relative to other European populations. Because of a greater risk of hyperbilirubinaemia due to hereditary haemolytic anaemia, the diagnosis of Gilbert syndrome in this group of patients is very important
Erythropoietin — the alternative treatment of anemia in infants
Niedokrwistość to jeden z najczęstszych problemów hematologicznych u niemowląt. Okresem
szczególnej podatności na tę chorobę są pierwsze 3 miesiące życia, w których może się ona
rozwijać na podłożu tak zwanej fizjologicznej niedokrwistości. Grupą niemowląt o zwiększonym
ryzyku niedokrwistości są wcześniaki oraz niemowlęta urodzone o czasie, które są obarczone
dodatkowymi czynnikami pogarszającymi parametry czerwonokrwinkowe, takimi jak
konflikt serologiczny, przebycie zakażenia czy utrata krwi w okresie okołoporodowym. Wśród
czynników determinujących wystąpienie niedokrwistości w pierwszych miesiącach życia kluczową rolę odgrywa niedobór erytropoetyny (Epo). Do niedawna jedynym dostępnym sposobem
leczenia opisanych pacjentów były uzupełniające transfuzje koncentratu krwinek czerwonych
(kkcz). Od lat 90. XX wieku leczeniem, które w wielu przypadkach może stanowić alternatywę
dla kkcz, stała się ludzka rekombinowana erytropoetyna (rHuEpo). Powstałe w ciągu 20 lat
bogate piśmiennictwo, dokumentujące liczne wieloośrodkowe badania, potwierdza wysoką
skuteczność i bezpieczeństwo rHuEpo w terapii niemowląt z niedokrwistością.
Hematologia 2011; 2, 1: 71–82Anemia is one of the most common hematological problems in infants. The first 3 months of
life are the period of special susceptibility to anemia development, because it may occur on the
basis of a physiological decrease in morphological parameters of blood. The risk group of
anemia are premature infants and term infants with additional complaints which have
a negative influence on hematological parameters, for instance presence of serological incompatibility,
infection or bleeding at birth or just after birth. Reduced production of erythropoietin
has a key role in determining the occurrence of anemia the decrease in blood morphology in the
first 3 months of life. Up to the recent years the only available treatment for this type of anemia
was supplementary transfusion of packed red blood cells. Since the 1990s recombinant human
erythropoietin (rHuEpo) has, in many cases, become an alternative treatment in such cases.
The rich literature, created on the basis of researches carried out in many centres all over the world, confirms high effectiveness and safety of rHuEpo in the treatment of anemia in the first
3 months of life.
Hematologia 2011; 2, 1: 71–8
Additional file 1: Table S1. of Two novel C-terminal frameshift mutations in the β-globin gene lead to rapid mRNA decay
Sequences of the primers. (DOCX 13 kb