PMS2 expression decrease causes severe problems in mismatch repair

PMS2 is one of the four susceptibility genes in Lynch syndrome (LS), the most common cancer syndrome in the world. Inherited mutations in DNA mismatch repair (MMR) genes, MLH1, MSH2, and MSH6, account for approximately 90% of LS, while a relatively small number of LS families segregate a PMS2 mutation. This and the low cancer penetrance in PMS2 families suggest that PMS2 is only a moderate or low-risk susceptibility gene. We have previously shown that even a partial expression decrease in MLH1, MSH2, or MSH6 suggests that heterozygous LS mutation carriers have MMR malfunction in constitutive tissues. Whether and how PMS2 expression decrease affects the repair capability is not known. Here, we show that PMS2 knockdown cells retaining 19%, 33%, or 53% of PMS2 expression all have significantly reduced MMR efficiency. Surprisingly, the cells retaining expression levels comparable to PMS2 mutation carriers indicate the lowest repair efficiency.Peer reviewe

Reduced mismatch repair gene expression and functional deficiency as indicators of Lynch syndrome

Lynch syndrome (LS, previously known as hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC) is an inherited cancer predisposition syndrome caused by DNA mismatch repair (MMR) malfunction. MMR mechanism is a post-replicative repair pathway. The mismatch in the DNA is recognised and bound by MutSα, heterodimer of the proteins MSH2 and MSH6, or less often by MutSβ (MSH2+MSH3), after which the recruitment of MutLα (MLH1+PMS2) heterodimer initiates the repair process. Up to 90% of LS causing mutations are found in MLH1, MSH2 and MSH6 genes, whereas PMS2 has been suggested to be only a low-risk LS susceptibility gene due to small number of families segregating a disease causing PMS2 mutation. Cancer predisposition in Lynch syndrome is inherited dominantly through one defective MMR gene allele and tumorigenesis starts only after the loss of the second allele, giving rise most commonly to early-onset colorectal and endometrial cancers, and more rarely cancers of the uterine, stomach, urinary tract, ovary, small intestine or bile tract. The risk of developing colorectal cancer is higher in MLH1 and MSH2 mutation carriers than in MSH6 and PMS2 mutation carriers. However, the risk of developing endometrial cancer seems to be the highest in MSH6 mutation carriers. Early diagnosis of LS families and MMR gene mutation carriers is extremely important, since risk-reducing clinical surveillance and prophylactic surgeries have been shown to reduce cancer-related mortality. LS diagnosis is generally based on cancer history of the family and on tumour studies, followed by genetic testing to determine a predisposing mutation. However, the atypical clinical phenotypes such as late age at onset, lower penetrance and different tumour spectrums associated with MSH6 and PMS2 families, as well as the increasing number of variants of uncertain significance (VUS) found in sequencing, complicate LS diagnosis and highlight the need for pathogenicity assessment. The present work aimed to study the functional effect of lowered MMR gene expression as indication of Lynch syndrome and to assess the pathogenicity of MMR gene variants of uncertain clinical significance. Here, we studied how decreased MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 gene expression levels affect MMR efficiency. Using a stable shRNA knockdown approach we generated and studied altogether eleven cell lines retaining 23%, 50% and 74% of MLH1, 26%, 47% and 68% of MSH2, 50% and 79% of MSH6, and 19%, 33% and 53% of PMS2 mRNA expression. The results of an in vitro MMR assay showed that the repair efficiency was not only associated with gene expression level but the expression decrease affected different genes differently. For MSH2 and MSH6 genes, an expression decrease to 75% already caused a significant decrease in MMR efficiency, while for PMS2 the repair capability decreased significantly near the mutation carrier level (~50%), and for MLH1 gene only at the lowest expression level (23%). Unexpectedly, 19% and 33% of PMS2 expression resulted in higher MMR efficiency than the carrier-like level, 53%, suggesting some kind of functional compensation for PMS2 repair activity in the cell. The functional significance of five MLH1 and four MSH2 VUSs found in suspected LS families was determined by the in vitro MMR assay. For that, nine recombinant MLH1 and MSH2 protein variants were used to complement MMR-deficient cancer cell lines lacking the normal respective protein. A MMR gene variant whose protein retained repair efficiency in the assay was determined MMR proficient, while variants that resulted in the lack of repair were determined MMR deficient. Here, the MLH1 variants p.Leu348Ser, p.Arg474Pro and p.Glu605Ala were shown to be MMR proficient and p.Gly101Ser and p.Leu260Arg deficient, while only one MSH2 variant p.Lys82Glu was MMR proficient and the variants p.Gly669Val, p.Phe694Ser and p.Pro696Leu deficient. Our results, together with the clinical and tumour data collected from the families, allowed the pathogenicity assessment of the MMR gene variants and Lynch syndrome diagnosis in the families. Findings from these studies provide new insights into the severity of the malfunction that decreased levels of different MMR genes expression may cause. Furthermore, the results show that the functional assessment of variants of uncertain significance considerably helps their pathogenicity assessment. Both of these findings may have an important impact on Lynch syndrome diagnosis in future.Lynch oireyhtymä (LS, aiempi nimi periytyvä ei-polypoottinen paksusuolisyöpä, HNPCC) on perinnöllinen syöpäalttiusoireyhtymä, joka liittyy puutteelliseen emäspariutumavirheiden korjaukseen (mismatch repair, MMR). MMR–mekanismi on DNA:n kahdentumisen eli replikaation jälkeen toimiva korjausmekanismi, jossa MSH2- ja MSH6-proteiinien muodostama heterodimeeri, MutSα, tai harvemmin MutSβ (MSH2 ja MSH3), tunnistaa ja sitoutuu virheeseen, jonka jälkeen MutLα (MLH1+PMS2) -proteiinikompleksin sitoutuminen siihen käynnistää korjausprosessin. Jopa 90% Lynch oireyhtymää aiheuttavista mutaatioista on löydetty MLH1-, MSH2- ja MSH6-geeneistä. Neljännen PMS2- alttiusgeenin on oletettu olevan vain matalan riskin alttiusgeeni, koska siitä löydetyt taudille altistavat mutaatiot ovat suhteellisen harvinaisia. LS periytyy vallitsevasti toiselta vanhemmalta, mutta syövän kehitys alkaa vasta kun toinenkin MMR-geenin kopio eli alleeli inaktivoituu. Syövät kehittyvät nuorella iällä yleisimmin paksusuoleen ja kohdunrunkoon, mutta kasvaimia voi kehittyä myös muun muassa mahalaukkuun, virtsateihin, munasarjoihin, ohutsuoleen ja sappiteihin. MLH1- ja MSH2 mutaatioiden kantajilla on korkeampi paksusuolisyöpäriski kuin MSH6- ja PMS2-mutaatioiden kantajilla, mutta riski kohdunrungon syöpään on havaittu olevan korkein MSH6-mutaation kantajilla. MMR-geenimuutosten kantajien ja LS-perheiden varhainen tunnistaminen on erityisen tärkeää, sillä korkean syöpäriskin henkilöille suunnatun ennaltaehkäisevän kliinisen seurannan ja kirurgisten toimenpiteiden on osoitettu vähentävän syöpäkuolemia huomattavasti. Nykyinen LS-diagnostiikka perustuu vahvasti syöpäpotilaan perheen syöpähistoriaan ja kasvaintutkimuksiin, jonka jälkeen syöville altistava geenimuutos pyritään löytämään geenitesteillä. Diagnosointia kuitenkin vaikeuttavat MSH6- ja PMS2-perheiden epätyypilliset kliiniset ilmiasut ja matalampi taudin penetraatio, sekä sekvensoinnilla MMR-geeneistä löytyvä alati kasvava määrä geenivariantteja, joiden kliininen merkittävyys on tuntematon (variant of uncertain significance, VUS) ja joiden patogeenisuuden todentaminen on siksi diagnoosin tekemiselle ensiarvoisen tärkeää. Tämän työn tavoitteena oli toiminnallista in vitro MMR-testiä käyttämällä selvittää neljän eri MMR-geenin alentuneen ilmentymisen (ekspression) vaikutusta geenin koodaaman proteiinin korjaustehokkuuteen osoituksena Lynch-oireyhtymästä sekä yhdeksän MLH1- ja MSH2-geeneistä löydetyn VUS:n patogeenisuus. Erityisenä tavoitteena oli selvittää miten erilaiset MLH1-, MSH2-, MSH6- ja PMS2-geenien alentuneet ilmentymistasot vaikuttavat geenien MMR-korjauskykyyn. Käyttäen stabiilia shRNA-hiljennysmenetelmää työssä rakennettiin ja tutkittiin yhteensä 11 solulinjaa, joissa oli 100% kontrolliin verrattuna jäljellä joko 23%, 50% tai 74% MLH1 mRNA:ta, 26%, 47% tai 68% MSH2 mRNA:ta, 50% tai 79% MSH6 mRNA:ta, tai 19%, 33% tai 53% PMS2 mRNA:ta. Toiminnallisella in vitro MMR-testillä osoitimme, että MMR-proteiinien korjauskyky ei pelkästään liittynyt geenien ilmentymistasoihin, mutta mRNA:n määrän väheneminen vaikutti varsin eri lailla eri geeneissä. Merkitsevä korjauskyvyn heikkeneminen tapahtui MSH6-geenillä jopa jo 79%:n ja MSH2-geenillä 68%:n ilmentymistasolla, kun taas PMS2-geenillä merkittävä korjaustehokkuuden lasku havaittiin mutaation kantajan tasoa vastaavalla ilmentymistasolla (53%). Sen sijaan MLH1-geenillä vastaava toiminnan heikentyminen vaati selkeästi suuremman laskun mRNA:n määrässä (23% jäljellä normaalitasosta). Huomattavaa oli, että PMS2-geenillä 19%:n ja 33%:n ilmentymistasoilla saavutettiin korkeammat MMR-tehokkuudet kuin 53%:n tasolla. Tämä voisi selittyä jonkinlaisella solun sisäisellä toiminnallisella kompensaatiomekanismilla. Toiminnallista MMR-testiä käytettiin myös selvittämään epäillyistä Lynch syndrooma-perheistä löydettyjen viiden MLH1- ja neljän MSH2-geenin VUS:ien vaikutusta proteiinien korjauskykyyn. Siinä variantin sisältämällä rekombinanttiproteiinilla komplementoitiin solulinjauute, joista kyseinen normaali MMR-proteiini oli poistettu. Variantit, joiden rekombinanttiproteiini palautti korjaustehokkuuden, tulkittiin MMR-toiminnallisiksi ja ne, jotka eivät kyenneet palauttamaan korjauskykyä, tulkittiin MMR-toimimattomiksi. Tutkituista MLH1-varianteista p.Leu348Ser, p.Arg474Pro ja p.Glu605Ala palauttivat korjauskyvyn ja tulkittiin MMR-toiminnallisiksi, kun taas p.Gly101Ser ja p.Leu260Arg tulkittiin MMR-toimimattomiksi. MSH2-varianteista ainoastaan p.Lys82Glu palautti korjauskyvyn, kun taas p.Gly669Val, pPhe694Ser ja p.Pro696Leu tulkittiin MMR-toimimattomiksi. Yhdessä perheistä kerätyn kliinisen tiedon ja syöpäkasvaimista kerätyn tiedon kanssa tuloksemme mahdollistivat MMR-geenivarianttien patogeenisyyden luotettavan arvioinnin ja LS diagnoosin tekemisen tai poissuljennan perheissä. Tämä väitöskirja tuotti täysin uutta tietoa MMR-geenien erilaisten ilmentymistasojen vaikutuksista solujen MMR-korjauskykyyn. Lisäksi tulokset osoittivat, että VUS:ien toiminnallinen analysointi auttaa huomattavasti kyseisten varianttien patogeenisuuden arvioinnissa. Näistä havainnoista voi olla suuresti hyötyä Lynch oireyhtymän diagnosointiin tulevaisuudessa

Tumor-independent Detection of Inherited Mismatch Repair Deficiency for the Diagnosis of Lynch Syndrome with High Specificity and Sensitivity

Lynch syndrome (LS) is the most common hereditary cancer syndrome. Early diagnosis improves prognosis and reduces health care costs, through existing cancer surveillance methods. The problem is finding and diagnosing the cancer predisposing genetic condition. The current workup involves a complex array of tests that combines family cancer history and clinical phenotypes with tumor characteristics and sequencing data, followed by a challenging task to interpret the found variant(s). On the basis of the knowledge that an inherited mismatch repair (MMR) deficiency is a hallmark of LS, we have developed and validated a functional MMR test, DiagMMR, that detects inherited MMR deficiency directly from healthy tissue without need of tumor and variant information. The validation included 119 skin biopsies collected from clinically pathogenic MMR variant carriers (MSH2, MSH6) and controls, and was followed by a small clinical pilot study. The repair reaction was performed on proteins extracted from primary fibroblasts and the interpretation was based on the MMR capability of the sample in relation to cutoff, which distinguishes MMR proficient (non-LS) from MMR deficient (LS) function. The results were compared with the reference standard (germline NGS). The test was shown to have exceptional specificity (100%) with high sensitivity (89%) and accuracy (97%). The ability to efficiently distinguish LS carriers from controls was further shown with a high area under the receiving operating characteristic (AUROC) value (0.97). This test offers an excellent tool for detecting inherited MMR deficiency linked to MSH2 or MSH6 and can be used alone or with conventional tests to recognize genetically predisposed individuals.Clinical validation of DiagMMR shows high accuracy in distinguishing individuals with hereditary MSH2 or MSH6 MMR deficiency (i.e., LS). The method presented overcomes challenges faced by the complexity of current methods and can be used alone or with conventional tests to improve the ability to recognize genetically predisposed individuals.Peer reviewe